本文選題：抗原特異性Treg細(xì)胞 + 人B淋巴細(xì)胞　； 參考：《華東師范大學(xué)》2012年碩士論文

【摘要】：CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Tregs)在維持免疫耐受、抑制自身免疫性疾病病理反應(yīng)及移植排斥反應(yīng)的過(guò)程中起著重要的作用。但是由于Treg細(xì)胞的表型和Treg細(xì)胞在外周血中數(shù)量甚少,限制了基于Treg細(xì)胞治療方法的臨床應(yīng)用。同時(shí)有文獻(xiàn)報(bào)道擴(kuò)增得到的Treg細(xì)胞的免疫治療效果大于初始的Treg細(xì)胞,因此,開(kāi)展體外誘導(dǎo)或擴(kuò)增大量Treg細(xì)胞的研究具有重要的意義。目前主要可以通過(guò)anti-CD3/CD28抗體包被的免疫磁珠結(jié)合IL-2體外廣譜擴(kuò)增Treg細(xì)胞,或者利用同種異基因抗原呈遞細(xì)胞(APCs)通過(guò)抗原特異性方式體外擴(kuò)增抗原特異性Treg細(xì)胞。前者擴(kuò)增得到的Treg細(xì)胞的抗原特異性較差,而后者的擴(kuò)增倍數(shù)較少。動(dòng)物模型研究表明抗原特異性Treg細(xì)胞在抑制自身免疫性疾病方面功能強(qiáng)于多克隆Treg細(xì)胞。 本文綜合了目前采用的各種擴(kuò)增方法,建立了通過(guò)同種異基因B細(xì)胞誘導(dǎo)產(chǎn)生抗原特異性Treg細(xì)胞的方法：即第一輪擴(kuò)增將免疫磁珠分選的人CD4+CD25+Foxp3+T細(xì)胞和人B淋巴細(xì)胞按1：4比例體外混合培養(yǎng)并加入外源白介素-2(IL-2)和抗CD28抗體；將第一輪擴(kuò)增得到的Treg細(xì)胞用anti-CD3/CD28抗體包被的免疫磁珠和IL-2刺激,進(jìn)行第二輪擴(kuò)增以獲得更多數(shù)量的抗原特異性Treg細(xì)胞,第二輪刺激分為添加或未添加免疫抑制劑雷帕霉素(Rapamycin, RAPA)兩組。本研究結(jié)果表明經(jīng)過(guò)兩輪的擴(kuò)增后,在第二輪擴(kuò)增中未添加RAPA組可擴(kuò)增1×103倍,純度80%；而添加RAPA組可擴(kuò)增0.8×103倍,純度90%。添加RAPA組得到的Treg細(xì)胞的Foxp3、CTLA4、CD39表達(dá)水平高于未添加RAPA組,但是HLA-DR變化不大。未添加RAPA組擴(kuò)增得到的Treg細(xì)胞分泌低水平的IL-2、IL-17、IL-4和IFN-γ,而添加RAPA組得到的Treg細(xì)胞幾乎不分泌上述各種細(xì)胞因子。體外擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明未添加RAPA組Treg細(xì)胞表現(xiàn)出部分免疫反應(yīng)無(wú)能性,而添加RAPA組Treg細(xì)胞則表現(xiàn)出完全的免疫反應(yīng)無(wú)能性。經(jīng)人B淋巴細(xì)胞擴(kuò)增得到的抗原特異性Treg細(xì)胞能夠有效地抑制同源抗原引起的免疫反應(yīng),而對(duì)多克隆刺激和異源抗原的免疫反應(yīng)抑制能力較弱,表明體外擴(kuò)增的Treg細(xì)胞呈現(xiàn)出抗原特異性特征。 本文采用人B細(xì)胞體外擴(kuò)增抗原特異性Treg細(xì)胞,再通過(guò)anti-CD3/CD28抗體包被的免疫磁珠進(jìn)一步進(jìn)行刺激可以在體外獲得大量的抗原特異性的Treg細(xì)胞,并且在加入雷帕霉素后可以有效地提高Treg細(xì)胞的純度和免疫抑制功能。本研究同時(shí)表明人B淋巴細(xì)胞擴(kuò)增得到的Treg細(xì)胞呈現(xiàn)出抗原特異性的特征。本研究結(jié)果為利用第三方無(wú)關(guān)供者Treg細(xì)胞進(jìn)行免疫治療的可行性提供了理論依據(jù)。 另外,本文還探討了通過(guò)調(diào)控細(xì)胞代謝途徑從CD4+CD25-T細(xì)胞體外誘導(dǎo)產(chǎn)生抗原特異性Treg細(xì)胞的方法。研究表明通過(guò)磷酸二酯酶(PDEs)抑制劑提高細(xì)胞胞內(nèi)cAMP水平不僅可以抑制T細(xì)胞增殖和IL-2的分泌,同時(shí)可誘導(dǎo)產(chǎn)生具有免疫抑制功能的Treg細(xì)胞。本文采用PDEs抑制劑Cilostamide和耐受型樹(shù)突狀細(xì)胞(tDCs),在分別添加不同的外源細(xì)胞因子條件下體外誘導(dǎo)CD4+CD25Foxp3-T細(xì)胞產(chǎn)生CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞。初步研究結(jié)果表明通過(guò)添加外源IL-2可以促進(jìn)Cilostamide誘導(dǎo)產(chǎn)生CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞。另外,在IL-2和Cilostamide存在的條件下,通過(guò)添加TGF-β可以提高Foxp3的表達(dá)水平。因此,在添加TGF-β和IL-2的條件下,Cilostamide和tDCs可以體外誘導(dǎo)產(chǎn)生Treg細(xì)胞。本研究結(jié)果將有助于進(jìn)一步有效地利用C ilostamide體外誘生功能性Treg細(xì)胞。
[Abstract]:CD4+CD25+Foxp3+ regulatory T cells (Tregs) play an important role in maintaining immune tolerance, inhibiting the pathological response of autoimmune diseases and transplantation rejection. However, the phenotype of Treg cells and the low number of Treg cells in the peripheral blood limit the clinical application of Treg based therapy. The immunotherapy of Treg cells obtained by channel amplification is more effective than the initial Treg cells. Therefore, it is of great significance to develop and amplify a large number of Treg cells in vitro. At present, it is possible to amplify Treg cells in vitro by anti-CD3/CD28 antibody coated immunomagnetic beads combined with IL-2 in vitro, or to present the same allogenic antigen with the same allogenic antigen. The antigen specific Treg cells were amplified by APCs in vitro. The antigen specificity of the former Treg cells was poor and the amplification of the latter was less. The animal model study showed that the antigen specific Treg cells were stronger than polyclonal Treg cells in the inhibition of autoimmune diseases.
In this paper, we synthesized various methods of amplification, and established a method of inducing antigen specific Treg cells by the same allogeneic B cells: first round amplification of human CD4+CD25+Foxp3+T cells and human B lymphocytes in vitro mixed in 1:4 ratio and adding exogenous interleukins -2 (IL-2) and anti CD28 resistance. The first round amplified Treg cells were amplified with anti-CD3/CD28 antibody coated immunomagnetic beads and IL-2 for second rounds of amplification in order to obtain more amounts of antigen specific Treg cells, and the second round of stimulation was divided into two groups of adding or without adding the immunosuppressant, rapamycin (Rapamycin, RAPA). The results of this study showed that two rounds were carried out. After amplification, the number of non RAPA groups in the second round amplification was 1 x 103 times, the purity was 80%, and the addition of RAPA group was 0.8 x 103 times, the purity 90%. added to the RAPA group, the Foxp3, CTLA4, CD39 expression level was higher than that of the non RAPA group, but the HLA-DR changed little. IL-17, IL-4 and IFN- gamma, and the Treg cells obtained from the RAPA group almost did not secrete the various cytokines. In vitro amplification experimental results showed that the Treg cells without the RAPA group showed partial immune response inenergy, while the addition of RAPA group Treg cells showed complete immune response incompetence. The antigen obtained by human B lymphocytes was obtained. Specific Treg cells can effectively inhibit the immune response caused by homologous antigens, but the ability to inhibit the immunoreaction of polyclonal and heterologous antigens is weak, indicating that the Treg cells in vitro are characterized by antigenic specificity.
The amplification of antigen specific Treg cells in vitro by human B cells and the further stimulation of the immunomagnetic beads coated with anti-CD3/CD28 antibody can obtain a large number of antigen specific Treg cells in vitro, and can effectively improve the purity and immunosuppressive function of Treg cells after adding rapamycin. The Treg cells derived from the B lymphocyte of the people of the Ming Dynasty are characterized by antigen specificity. The results of this study provide a theoretical basis for the feasibility of using third party independent donor Treg cells for immunotherapy.
In addition, the method of inducing antigen specific Treg cells from CD4+CD25-T cells by regulating cell metabolic pathways is also discussed. The study shows that the enhancement of intracellular cAMP level by phosphodiesterase (PDEs) inhibitors not only inhibits the proliferation of T cells and the secretion of IL-2, but also induces the production of immunosuppressive function. Treg cells. This paper uses PDEs inhibitor Cilostamide and tolerance dendritic cells (tDCs) to induce CD4+CD25Foxp3-T cells to produce CD4+CD25+Foxp3+Treg cells under the conditions of adding different exogenous cytokines respectively. The preliminary results show that the addition of exogenous IL-2 can promote Cilostamide induced CD4+CD25+Foxp3+Treg to produce CD4+CD25+Foxp3+Treg. In addition, under the condition of IL-2 and Cilostamide, the expression level of Foxp3 can be enhanced by adding TGF- beta. Therefore, Cilostamide and tDCs can induce Treg cells in vitro under the condition of adding TGF- beta and IL-2. The results of this study will help to further effectively use C ilostamide to induce functional Treg cells in vitro.

【學(xué)位授予單位】：華東師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號(hào)】：R392

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本文編號(hào)：1848670