本文選題：生精細(xì)胞 + 圓形精子��； 參考：《安徽醫(yī)科大學(xué)》2012年碩士論文

【摘要】：第一部分小鼠單倍體精子細(xì)胞顯微注射方法學(xué)研究 目的：探討改良持卵針的顯微操作系統(tǒng)在小鼠精子細(xì)胞體外授精中的應(yīng)用價值。 方法：通過反復(fù)鍛燒將常規(guī)持卵針制作成喇叭形開口狀，制成改良持卵針，輔以獨特的顯微注射操作手法，對小鼠生精細(xì)胞體外培養(yǎng)所獲單倍體圓形精子進行卵胞漿內(nèi)顯微注射（ROSI），計算ROSI后30min昆明小白鼠卵母細(xì)胞的存活數(shù)和存活率，并與常規(guī)窄口持卵針行ROSI后的卵母細(xì)胞存活率進行比較。 結(jié)果：分別采用常規(guī)和改良后的持卵針進行小鼠ROSI，每種方法各注射320個卵母細(xì)胞。改良持卵針組ROSI后30min的卵母細(xì)胞存活率顯著高于未改進持卵針組（P0.05）。 結(jié)論：改良持卵針制備簡單，，易于操作，ROSI后卵母細(xì)胞存活率高，且不需依賴piezo系統(tǒng)，在小鼠單倍體精子細(xì)胞體外受精的研究中有較高的臨床應(yīng)用價值。 第二部分化學(xué)激活在小鼠圓形精子體外受精中的應(yīng)用 目的：通過對生精細(xì)胞體外培養(yǎng)所獲圓形精子顯微注射后的小鼠卵母細(xì)胞進行單一和聯(lián)合化學(xué)激活，尋找小鼠圓形精子體外受精的最佳激活方案。 方法：選取乙醇（ethanol，EH）、鈣離子載體A23187(calcium ionophore A23187，CIA)、離子霉素（ionomycin，Ion）、氯化鍶（strontium chloride，SrCl2）、放線菌酮（cycloheximide，CHX）及6-二甲基苯胺嘌呤(6-dimethylaminopurine，6-DMAP)作為外源性化學(xué)激活劑，采用不同濃度的單一化學(xué)激活劑對ROSI后的卵母細(xì)胞進行不同作用時間激活，觀察其受精率、卵裂率和桑囊胚形成率。根據(jù)激活不同的途徑，聯(lián)合兩種最佳激活濃度和激活時間的單一激活劑對ROSI后的卵母細(xì)胞進行聯(lián)合激活，比較不同聯(lián)合方案對卵母細(xì)胞的激活效果；并以成年小鼠睪丸內(nèi)圓形精子ROSI作為對照，比較體內(nèi)精子細(xì)胞和體外培養(yǎng)精子細(xì)胞的受精能力及胚胎發(fā)育潛能。 結(jié)果：（1）單一激活時，各激活劑的最佳方案分別為①乙醇：7%、6min；②CIA：5μmol/L、5min；③Ion：5μmol/L、5min；④6-DMAP：2mmol/L、2h；⑤SrCl2：10mmol/L、1.5h；⑥CHX：10μg/mL、1.5h，其中10mmol/L SrCl2作用1.5h激活效果最佳，顯著優(yōu)于CHX方案，但與其它各組無顯著性差異；（2）聯(lián)合激活時，乙醇+6-二甲基苯胺嘌呤組桑囊胚率（29.63%）顯著高于其它各組，以及除SrCl2以外所有單一激活方案（P0.05），為最佳聯(lián)合激活方案；（3）對成年小鼠睪丸中圓形精子ROSI后的卵母細(xì)胞進行乙醇+6-二甲基苯胺嘌呤激活后，其正常受精率、卵裂率及桑囊胚率與體外培養(yǎng)所獲圓形精子間均無顯著性差異。 結(jié)論：單一激活方案中10mmol/L SrCl2單獨作用1.5h，聯(lián)合方案中7%EH作用6min+2mmol/L6-DMAP作用2h對體外培養(yǎng)所獲圓形精子ROSI后的卵母細(xì)胞激活效果最佳；體外培養(yǎng)所獲圓形精子ROSI后受精率、胚胎發(fā)育潛能與成年小鼠睪丸內(nèi)圓形精子間無顯著性差異。
[Abstract]:Study on microinjection of haploid spermatozoa in mice Objective: to study the application value of modified microoperating system of egg holding needle in mouse sperm cell insemination in vitro. Methods: the conventional egg holding needle was made into a horn shaped opening by repeated burning, and an improved egg holding needle was made with a unique microinjection technique. Haploid round spermatozoa obtained from mouse spermatogenic cells in vitro were microinjected into oocyte cytoplasm to calculate the survival number and survival rate of 30min Kunming mouse oocytes after ROSI. The survival rate of oocytes was compared with that of conventional narrow needle holding oocyte after ROSI. Results: mice ROSIs were treated with conventional and modified oocyte holding needles. 320 oocytes were injected into each method. The survival rate of 30min oocytes in the modified oocyte holding needle group was significantly higher than that in the unmodified egg holding needle group after ROSI. Conclusion: the modified oocyte holding needle is simple to be prepared, easy to operate and has high survival rate of oocytes, and does not depend on piezo system, so it has high clinical application value in the study of in vitro fertilization of mouse haploid sperm cells. Application of Chemical Activation in in Vitro fertilization of Mouse Round sperm Aim: to find out the best method of in vitro fertilization of round spermatogenic cells by single and combined chemical activation of mouse oocytes obtained by microinjection of spermatogenic cells. Methods: ethanolus, A23187(calcium ionophore A23187 CIAA, ionomycin Ionn, Strontium chlorideum chloride, cycloheximidede CHX and 6-dimethylaminopurine 6-DMAPs were used as exogenous chemical activators. Different concentrations of single chemical activator were used to activate oocytes after ROSI for different time. The fertilization rate, cleavage rate and blastocyst formation rate were observed. According to the different ways of activation, two kinds of single activator of optimal activation concentration and activation time were combined to activate oocytes after ROSI, and the effects of different combination schemes on oocyte activation were compared. The fertilization ability and embryonic development potential of spermatozoa in vivo and in vitro were compared with round spermatozoa ROSI in adult mouse testis. Results under the single activation, the best scheme for each activator was 1 ethanol 7: 7 and 2CIA: 5 渭 mol / L 5 min Ion: 5 渭 mol / L 5min 46-DMAP: 2mmol / L 2hmol / L 5SrCl 2: 10mmol / L 1.5hl 6CHX% 10 渭 g mLL = 1.5h. among them, 10mmol/L SrCl2 had the best activation effect for 1.5h, which was significantly better than the CHX scheme, but had no significant difference with other groups. The mulberry blastocyst rate of alcohol 6-dimethylaniline group was significantly higher than that of other groups. The normal fertilization rate of oocytes after ROSI was activated by alcohol 6-dimethylaniline in adult mouse testis, and all the single activation regimen (P0.05G, except SrCl2) was the best combination. There was no significant difference between cleavage rate and blastocyst rate and round spermatozoa in vitro. Conclusion: 10mmol/L SrCl2 alone in single activation regimen and 7%EH in combination with 6min 2mmol/L6-DMAP for 2 h have the best effect on oocyte activation after ROSI obtained from round sperm in vitro, and fertilization rate after ROSI in vitro. There was no significant difference between embryonic development potential and round spermatozoa in testis of adult mice.
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號】：R321

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本文編號：1844143