本文選題：去分化脂肪細(xì)胞(DA) + 脂肪組織工程��； 參考：《南方醫(yī)科大學(xué)》2011年博士論文

【摘要】：背景及目的 隨著整復(fù)重建外科的發(fā)展,自體組織移植及人工材料替代修復(fù)軟組織缺損成為重要的治療手段,盡管這能有效地改善受區(qū)的組織缺損狀況,但自體移植物的來(lái)源十分有限,又常受到血供及其供區(qū)的繼發(fā)畸形的限制,游離脂肪移植的自體吸收率較高,人工材料易產(chǎn)生排斥反應(yīng)等,故目前這些方法的治療效果均不是十分理想,難以完全滿足臨床的需要。組織工程技術(shù)的出現(xiàn)為臨床上更好的解決組織缺損等難題提供了一個(gè)新的思路。 近年來(lái),組織工程技術(shù)能以少量種子細(xì)胞,經(jīng)體外擴(kuò)增后與生物材料復(fù)合,修復(fù)較大的組織或器官缺損,重建生理功能,為真正實(shí)現(xiàn)無(wú)損傷修復(fù)組織缺損和真正意義上的形態(tài)、結(jié)構(gòu)與功能重建開(kāi)辟了新的途徑。組織工程學(xué)的發(fā)展需要幾個(gè)必備的因素,即：(1)可獲得的種子細(xì)胞,并能控制其生長(zhǎng)和組織形成；(2)結(jié)構(gòu)精確的三維支架,以適合再造需要的組織量和形狀,而且與細(xì)胞具有良好的組織相容性；(3)適宜的微環(huán)境,能提供充分的血供和營(yíng)養(yǎng),維持細(xì)胞增殖和組織功能。 近年來(lái),人脂肪組織來(lái)源的干細(xì)胞(Adipose derived stem cells, ASCs)成為當(dāng)今干細(xì)胞研究領(lǐng)域的一大熱點(diǎn)。但ASCs是位于人脂肪組織內(nèi)的一個(gè)混雜細(xì)胞群體。只有大約40%的細(xì)胞能向脂肪細(xì)胞分化。因此,ASCs并不能完全滿足脂肪組織工程的發(fā)展需要。故尋找一種分離容易、增殖能力強(qiáng)、成脂分化率高的更優(yōu)秀的種子細(xì)胞仍然是研究熱點(diǎn)。 脂肪組織內(nèi)含有多種不同的細(xì)胞,主要有成熟脂肪細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、組織細(xì)胞和干細(xì)胞等。大量的脂質(zhì)聚集使脂肪細(xì)胞具有的漂浮性,導(dǎo)致細(xì)胞難于體外培養(yǎng),因此對(duì)該細(xì)胞的特性研究很少。脂肪細(xì)胞由此被認(rèn)為是處于分化終末期,缺乏增殖能力的一種細(xì)胞。有研究表明,成熟脂肪細(xì)胞在體外培養(yǎng)的過(guò)程中,能脫去脂滴,重新啟動(dòng)增殖機(jī)制,開(kāi)始分裂增生。我們把這種生理轉(zhuǎn)變稱之為脂肪細(xì)胞去分化。 脂肪細(xì)胞去分化將開(kāi)創(chuàng)細(xì)胞生理學(xué)一個(gè)令人驚喜的領(lǐng)域,改變?nèi)藗儗?duì)于組織再生能力的許多觀點(diǎn)。然而,關(guān)于去分化脂肪細(xì)胞(dedifferentiate adipocyte, DA)的細(xì)胞生物學(xué)特性研究還很少。前期研究證實(shí)DA在體外定向誘導(dǎo)培養(yǎng)下具有向成脂、成骨、成軟骨分化等多向分化能力,且較之ASCs有更高的成脂能力。因此,DA有可能成為脂肪組織工程更具前景的種子細(xì)胞來(lái)源。 組織工程常用的支架材料分為天然材料和人工合成材料,天然材料包括：天然多糖類材料有纖維素、甲殼素、透明質(zhì)酸等；天然蛋白質(zhì)類材料有膠原和纖維蛋白等；人工合成的材料有聚乳酸(PLA)、聚乙醇酸(PGA)或兩者聚合物聚乳酸-聚乙醇酸(PLGA)、聚四氟乙烯、羥基磷灰石、聚乙烯醇、海藻酸鹽等。依據(jù)他們各自特點(diǎn),被不同程度地應(yīng)用于組織工程的研究。由于應(yīng)用脂肪細(xì)胞組織工程技術(shù)修復(fù)軟組織缺損近期才引起學(xué)者們的關(guān)注,故而用于構(gòu)建脂肪組織工程有效的生物材料支架研究不多,目前常用的有可降解的多孔泡沫,如PLGA、透明質(zhì)酸、膨體聚四氟乙烯等,然而,究竟何種材料能成為脂肪組織工程種子細(xì)胞的理想載體尚不十分明確,如果能找出最適合構(gòu)建工程化脂肪的支架材料,將能大大促進(jìn)脂肪組織工程的研究。 本實(shí)驗(yàn)擬研究人DA向脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞體外定向誘導(dǎo)分化中相關(guān)基因表達(dá),同時(shí)判斷種子細(xì)胞與Ⅰ型固態(tài)膠原支架及纖維蛋白膠可注射支架復(fù)合后在體內(nèi)構(gòu)建組織工程化脂肪組織的可能性,以尋找適宜的脂肪組織工程種子細(xì)胞載體,探索構(gòu)建組織工程化脂肪組織的有效方法；另外,對(duì)DA進(jìn)行AD、EGFP體外熒光標(biāo)記,觀察該標(biāo)記物對(duì)細(xì)胞生物性狀的影響,為種子細(xì)胞研究尋找理想的細(xì)胞標(biāo)記方法。 方法 1、DA、ASCs的分離、培養(yǎng)及檢測(cè) 自成人吸脂術(shù)后抽吸物提取成熟脂肪細(xì)胞及ASCs,天花板貼壁培養(yǎng)法誘導(dǎo)成熟脂肪細(xì)胞去分化,觀察細(xì)胞形態(tài)變化,獲得DA。同時(shí)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行體外定向成脂、成骨誘導(dǎo)分化,并以油紅0染色、茜素紅染色進(jìn)行鑒定。Real-time PCR分析細(xì)胞內(nèi)PPARγ、C/EBPα、C/EBPβ、Leptin、LPL、RUNX2、SOX9的表達(dá)水平。 2.Ad.EGFP轉(zhuǎn)染并標(biāo)記DA Ad.EGFP按不同感染復(fù)數(shù)(multiphcity of infection, MOI)值(MOI=0,10,20,30,50,100)體外轉(zhuǎn)染DA,進(jìn)行EGFP熒光標(biāo)記,倒置顯微鏡及熒光顯微鏡觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況及傳代后熒光強(qiáng)度的變化；測(cè)定腺病毒轉(zhuǎn)染DA的效率；油紅0染色檢測(cè)細(xì)胞標(biāo)記后成脂能力。使用MTT比色分析法檢測(cè)標(biāo)記前后細(xì)胞的增殖情況,同時(shí)將培養(yǎng)細(xì)胞上清液進(jìn)行乳酸脫氫酶(LDH)含量測(cè)定,檢測(cè)Ad.EGFP對(duì)細(xì)胞的毒性。 3、DA與海綿狀Ⅰ型膠原蛋白、纖維蛋白膠生物相容性的檢測(cè) 將標(biāo)記后的DA分別與Ⅰ型膠原蛋白海綿支架、纖維蛋白膠體外聯(lián)合培養(yǎng),測(cè)定細(xì)胞在支架上的黏附率,相差顯微鏡及電子顯微鏡動(dòng)態(tài)觀察細(xì)胞在支架上黏附、伸展、生長(zhǎng)和增殖情況；使用臺(tái)盼藍(lán)拒染法檢測(cè)細(xì)胞活力,油紅0染色檢測(cè)細(xì)胞復(fù)合支架后成脂能力。 4、體內(nèi)工程化脂肪組織的構(gòu)建 將Ⅰ型膠原支架與纖維蛋白膠可注射支架分別與GFP標(biāo)記的成脂誘導(dǎo)后DA或ASCs混合,設(shè)空白支架為對(duì)照組,同體雙側(cè)植入裸鼠背部皮下,12周后取出植入物。進(jìn)行組織工程新生物大體觀察和濕重測(cè)定后熒光顯微鏡觀察大體組織標(biāo)本,最后組織學(xué)檢測(cè)、HE染色定性。血管計(jì)數(shù)法檢測(cè)新生物血管密度。 結(jié)果 1.分離培養(yǎng)的DA形態(tài)類似于成纖維細(xì)胞,具有很強(qiáng)的增殖及多向分化能力。在脂肪、成骨分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基的作用下,分化出成熟的脂肪細(xì)胞和成骨細(xì)胞,油紅0、茜素紅染色陽(yáng)性。細(xì)胞誘導(dǎo)分化前,DA內(nèi)PPARγ、C/EBPβ的表達(dá)高于ASCs,而RUNX2.SOX9的表達(dá)低于ASCs.細(xì)胞成脂誘導(dǎo)后,DA內(nèi)PPARγ、C/EBPα、C/EBPβ、Leptin、LPL的基因表達(dá)始終高于ASCs,增加的幅度更大；而成骨誘導(dǎo)后,ASCs內(nèi)RUNX2的表達(dá)水平始終高于DA。 2.Ad.EGFP可成功進(jìn)入DA。24h可見(jiàn)綠色熒光,5d熒光表達(dá)強(qiáng)度明顯較高,DA傳代后仍有強(qiáng)熒光表達(dá)。轉(zhuǎn)染DA后,不影響其增殖活性。MOI為0、10、20、30、50、100時(shí)轉(zhuǎn)染率分別為0%、11.3%、28.5%、43.7%、95.8%、96.3%。細(xì)胞標(biāo)記后不影響向脂肪細(xì)胞分化的能力。 3.DA可以在海綿狀Ⅰ型膠原蛋白支架、纖維蛋白膠支架上生長(zhǎng)并逐漸黏附,細(xì)胞與不同的支架混合,細(xì)胞在支架上的黏附率也不同：DA在海綿狀Ⅰ型膠原蛋白支架組(n=6)的細(xì)胞黏附率為77.67%±3.33%；DA在纖維蛋白膠組(n=6)的細(xì)胞黏附率為91.83%±2.79%,兩組采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=7.996,P0.001)。而DA在海綿狀Ⅰ型膠原蛋白支架組(n=6)的細(xì)胞成脂分化率為63.0%±3.0%；DA在纖維蛋白膠組(n=6)的細(xì)胞成脂分化率為63.2%±3.3%,兩組采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)比較無(wú)顯著性差異(t=0.091,P=0.929)。DA與支架混合培養(yǎng)后不影響細(xì)胞的形態(tài)、生長(zhǎng)增殖狀況,細(xì)胞與支架復(fù)合后不影響向脂肪細(xì)胞分化的能力。 4.術(shù)后12w取材發(fā)現(xiàn),DA-膠原蛋白組、ASCs-膠原蛋白組、DA-纖維蛋白膠組、ASCs-纖維蛋白膠組于移植物包埋區(qū)均可觀察到新生組織形成；空白對(duì)照組(完全培養(yǎng)基-膠原支架組、完全培養(yǎng)基-纖維蛋白膠組)均未見(jiàn)新生組織形成。DA-膠原蛋白組(n=6)新生組織平均濕重為0.0728±0.0184g；ASCs-膠原蛋白組(n=6)新生組織平均濕重為0.0732±0.0198g；DA-纖維蛋白膠組(n=6)新生組織平均濕重為0.1109±0.0020g, ASCs-纖維蛋白膠組(n=6)新生組織平均濕重為0.1080±0.0028g。DA-膠原蛋白組與ASCs-膠原蛋白組、DA-纖維蛋白膠組與ASCs-纖維蛋白膠組之間濕重比較,無(wú)顯著性差異(均為P0.05)。HE染色證實(shí)新生組織均為成熟脂肪組織,支架已完全吸收降解；免疫熒光染色陽(yáng)性證實(shí)新生組織為外源性。各組新生微血管密度分別為：DA-膠原蛋白組11.22±2.53;ASCs-膠原蛋白組15.22±2.39；DA-纖維蛋白膠組10.72±2.42:ASCs-纖維蛋白膠組15.00±2.54。DA-膠原蛋白組與ASCs-膠原蛋白組、DA-纖維蛋白膠組與ASCs-纖維蛋白膠組之間微血管密度比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均0.05)。各組新生物纖維化程度分別為：DA-膠原蛋白組24.90%±0.49%；ASCs-膠原蛋白組25.10%±0.73%;DA-纖維蛋白膠組25.00%±0.75%；ASCs纖維蛋白膠組24.70%±0.72%。DA-膠原蛋白組與ASCs-膠原蛋白組、DA-纖維蛋白膠組與ASCs-纖維蛋白膠組之間纖維化程度比較,無(wú)顯著性差異(均為P0.05)。在體內(nèi),DA表達(dá)內(nèi)皮細(xì)胞表面標(biāo)記——CD31,參與血管的形成。 討論 種子細(xì)胞是構(gòu)建組織工程脂肪核心問(wèn)題之一。在脂肪組織中成熟脂肪細(xì)胞已被證實(shí)能去分化為DA, DA具有強(qiáng)增殖能力,多向分化能力,高成脂分化率。本實(shí)驗(yàn)從人脂肪組織成功獲取脂肪細(xì)胞,天花板貼壁培養(yǎng)誘導(dǎo)去分化獲得DA。DA作為種子細(xì)胞與其他細(xì)胞相比具有相當(dāng)?shù)膬?yōu)越性,該細(xì)胞來(lái)源廣泛、取材容易,大量獲取,高成脂分化率。 組織工程另一核心內(nèi)容是尋找具有組織再生潛力的支架材料。在生物材料方面,已開(kāi)發(fā)和研制了適用于不同組織構(gòu)建的生物支架材料。各類材料都具有各自的優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn),而膠原蛋白在組織工程構(gòu)建中作為支架材料的效果已被肯定。在這個(gè)實(shí)驗(yàn)中,顯示膠原蛋白作為支架材料與ASCs有良好的相容性及黏附性,對(duì)細(xì)胞無(wú)毒性,不影響細(xì)胞增殖。 同時(shí),細(xì)胞標(biāo)記一直是困擾組織工程技術(shù)修復(fù)機(jī)制研究的一大難題,其在干細(xì)胞來(lái)源的種子細(xì)胞的缺損修復(fù)研究中尤為重要。尋找一種直觀、長(zhǎng)期穩(wěn)定,同時(shí)不影響細(xì)胞組織形成能力的標(biāo)記方法非常重要。在本實(shí)驗(yàn)中,EGFP對(duì)DA成功進(jìn)行了標(biāo)記,且具有上述優(yōu)點(diǎn)。 在這個(gè)實(shí)驗(yàn)中,脂肪分化誘導(dǎo)后的DA與ASCs一樣,與Ⅰ型膠原、或纖維蛋白膠支架混合培養(yǎng)后能在裸鼠皮下新生結(jié)構(gòu)功能完整的脂肪組織塊。該研究提示,DA作為種子細(xì)胞的確可以應(yīng)用于脂肪組織的組織工程研究,并且能合成具有三維結(jié)構(gòu)及功能的脂肪組織。 結(jié)論 1、本實(shí)驗(yàn)成功地從人皮下脂肪組織中誘導(dǎo)培養(yǎng)出DA,建立了一整套有關(guān)DA分離、培養(yǎng)和鑒定的較簡(jiǎn)便的方法。DA具有很強(qiáng)的增殖和自我更新能力,具有向脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞分化的潛能,尤其是高成脂分化力。DA來(lái)源豐富、取材容易,創(chuàng)傷小,是理想的組織工程種子細(xì)胞,具有廣闊的應(yīng)用前景。 2、腺病毒是較好的基因載體,是一個(gè)高效、安全快捷的基因修飾操作系統(tǒng),EGFP在DA中能持續(xù)穩(wěn)定表達(dá),將為基因治療和細(xì)胞示蹤提供有效的實(shí)驗(yàn)方法。EGFP對(duì)細(xì)胞無(wú)毒副作用,安全性高,對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖及成脂分化無(wú)明顯影響。 3、DA可以在海綿狀Ⅰ型膠原蛋白、纖維蛋白膠支架上逐漸黏附,細(xì)胞黏附率高,生長(zhǎng)、增殖良好。支架對(duì)細(xì)胞無(wú)毒性反應(yīng)。海綿狀Ⅰ型膠原蛋白、纖維蛋白膠材料與DA之間具有良好的生物相容性。 4、以膠原蛋白和可注射型纖維蛋白膠為支架材料,復(fù)合體外培養(yǎng)的人DA,能在體內(nèi)成功構(gòu)建成熟的脂肪組織塊,并證實(shí)細(xì)胞參與血管內(nèi)皮的構(gòu)成。該研究提示,DA也能為將來(lái)軟組織缺損的組織工程修復(fù)提供重要的種子細(xì)胞來(lái)源,并為體內(nèi)研究脂肪細(xì)胞的生長(zhǎng)代謝提供了研究模型。
[Abstract]:Background and Purpose

With the development of reconstructive surgery , autologous tissue transplantation and replacement of artificial materials have become an important means of treatment , although this can effectively improve the tissue defect situation of the affected area , but the source of autografts is very limited , and the self - absorption rate of free fat transplantation is high , and the artificial material is easy to generate rejection reaction . Therefore , the treatment effect of free fat transplantation is not ideal , so the clinical need is difficult to be completely met .

In recent years , tissue engineering technology can be combined with biological materials in a small number of seed cells to repair large tissue or organ defects , rebuild physiological function , and open up a new way for the real realization of the defect of tissue defect and real sense . Tissue engineering development needs several necessary factors , namely : ( 1 ) the available seed cells , and can control the growth and the formation of tissue ;
( 2 ) a three - dimensional scaffold with precise structure , which is suitable for the quantity and shape of tissues needed for reconstruction , and has good tissue compatibility with the cells ;
( 3 ) Suitable microenvironment can provide adequate blood supply and nutrition , maintain cell proliferation and tissue function .

In recent years , Adipose derived stem cells ( ASCs ) have become a hot spot in the field of stem cell research . But ASCs are a hybrid cell group located in human adipose tissue . Only about 40 % of cells can differentiate into adipocytes . Therefore , ASCs can not fully meet the development needs of adipose tissue engineering .

Adipose tissue contains many different kinds of cells , mainly including mature adipocytes , vascular endothelial cells , fibroblasts , tissue cells and stem cells .

However , there are few studies on the biological characteristics of dedifferentiated adipocytes ( DA ) . However , there are few studies on the biological characteristics of dedifferentiated adipocytes ( DA ) .

The scaffold materials commonly used in tissue engineering are divided into natural materials and synthetic materials , and natural materials include natural polysaccharide materials such as cellulose , chitin , hyaluronic acid and the like ;
natural protein materials include collagen and fibrin , etc . ;
Artificial synthetic materials include polylactic acid ( PLA ) , polyglycolic acid ( PGA ) or polymer polylactic acid - polyglycolic acid ( PLGA ) , polytetrafluoroethylene , hydroxyapatite , polyvinyl alcohol , alginate , etc . Based on their respective characteristics , it has been widely used in tissue engineering .

In this experiment , we studied the expression of related genes in the differentiation of human DA into adipocytes and osteoblasts in vitro . At the same time , it was concluded that the possibility of tissue engineering adipose tissue was constructed in vivo after the combination of seed cells with type I solid collagen scaffold and fibrin glue injectable scaffold in order to find suitable seed cell carriers for adipose tissue engineering , and to explore the effective methods of constructing tissue engineering adipose tissue ;
In addition , in vitro fluorescence labeling of AD and EGFP was carried out on DA , and the effect of the marker on the biological characters of cells was observed . The ideal cell labeling method was found for the seed cell research .

method

Isolation , Culture and Detection of 1 , DA and ASCs

The expression level of PPAR緯 , C / EBP 偽 , C / EBP 尾 , leptin mRNA , RUNX2 , SOX9 in cells was analyzed by Real - time PCR .

2 . Ad . EGFP transfection and marking DA

Ad . EGFP was transfected into DA in vitro according to the value of multiphcity of infection , and the fluorescence intensity after passaging was observed by fluorescence microscope and fluorescence microscope .
The efficiency of adenovirus - transfected DA was determined .
The proliferation of the cells before and after labeling was detected by MTT colorimetric assay , and the cytotoxicity of Ad . EGFP on the cells was detected by the determination of lactate dehydrogenase ( LDH ) content in the culture supernatant .

3 . Detection of the biocompatibility of collagen and fibrin glue of type 鈪，

本文編號(hào)：1839644