本文選題：微小RNA + miR-101　； 參考：《天津醫(yī)科大學(xué)》2011年碩士論文

【摘要】：目的:微小RNA(microRNA,miRNA)是一類非編碼調(diào)控性單鏈小分子RNA,能夠與特異性的靶mRNA通過堿基配對結(jié)合,對靶基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控。近年來的研究表明miRNA不僅參與正常細(xì)胞功能的調(diào)控,也在病毒與宿主之間的作用以及病毒復(fù)制等方面發(fā)揮著重要的作用。單純皰疹病毒Ⅰ型(Herpes simpleX virus type 1,HSV-1)是一種DNA病毒,它可以引起口唇皰疹等疾病,并可以潛伏在三叉神經(jīng)節(jié)形成潛伏感染。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)皰疹病毒本身可以編碼病毒的miRNA,而且其表達(dá)的改變對病毒自身的復(fù)制有一定的作用,但宿主miRNA與病毒復(fù)制的關(guān)系并不是很明確,此研究的目的即探尋是否有宿主的miRNA參與了病毒復(fù)制的調(diào)控過程,這一調(diào)控過程是通過哪些基因?qū)崿F(xiàn)的。方法:首先在HeLa細(xì)胞中,過表達(dá)和封閉miR-101后,利用病毒滴定空斑形成實驗和real-time PCR分別檢測病毒復(fù)制能力的變化。而后利用生物信息學(xué)方法篩選出miR-101的候選靶基因,并利用熒光報告載體實驗驗證miR-101對靶基因的直接調(diào)控作用。利用real-time PCR和western blot實驗技術(shù)檢測miR-101對靶基因mRNA和蛋白水平的表達(dá)變化。然后過表達(dá)靶基因的全長,進(jìn)行挽救實驗,進(jìn)一步驗證miR-101對靶基因的調(diào)控作用。利用RNA干擾技術(shù)敲除該靶基因后,通過病毒滴定空斑形成實驗和real-time PCR實驗檢測靶基因?qū)Σ《緩?fù)制的影響,進(jìn)一步研究了該靶基因的功能。最后用real-time PCR檢測HSV-1感染HeLa細(xì)胞后內(nèi)源的miR-101和ATP5B的表達(dá)水平。結(jié)果:在HeLa細(xì)胞中,過表達(dá)miR-101后,病毒的復(fù)制明顯受到抑制,病毒空斑的形成明顯降低,病毒的DNA聚合酶基因的水平也明顯降低。封閉miR-101后,病毒的復(fù)制增強(qiáng),病毒的DNA聚合酶基因的水平也增加。靶基因篩選結(jié)果表明,ATP5B是miR-101的候選靶基因,其3'非翻譯區(qū)包含miR-101的潛在結(jié)合位點(diǎn)。熒光報告載體實驗證實,miR-101能夠通過作用于ATP5B基因的3'非翻譯區(qū)對其表達(dá)進(jìn)行負(fù)性調(diào)節(jié)。在HeLa細(xì)胞中過表達(dá)miR-101,ATP5B的mRNA和蛋白水平都有明顯降低;封閉miR-101后,ATP5B的mRNA和蛋白水平升高。此外,過表達(dá)不含3'UTR的ATP5B基因可以減弱miR-101對病毒增殖的抑制作用,病毒復(fù)制能力得到恢復(fù)。同時,在HeLa細(xì)胞中,敲降A(chǔ)TP5B后,病毒空斑的形成和病毒的DNA含量明顯降低,與過表達(dá)miR-101相一致。在HSV-1感染HeLa細(xì)胞后,隨著感染時間延長,miR-101的水平逐漸增加,其靶基因ATP5B的水平逐漸降低,二者呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)性。結(jié)論:miRNA作為細(xì)胞基因轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)的內(nèi)源性分子,參與調(diào)控病毒與宿主細(xì)胞的相互作用。本研究首次發(fā)現(xiàn)宿主細(xì)胞編碼的miR-101具有抗病毒作用。miR-101通過降低靶基因ATP5B的表達(dá)而抑制HSV-1在HeLa細(xì)胞中增殖。在HSV-1感染HeLa細(xì)胞后,miR-101的水平逐漸增加,其靶基因ATP5B的水平逐漸降低,說明HSV-1可以通過抑制宿主的miRNA抗病毒作用來維持自身的增殖。首次確定miR-101及其靶基因?qū)SV-1復(fù)制的調(diào)控作用,有利于我們對病毒感染的發(fā)生和發(fā)展進(jìn)行深入的了解,同時也為病毒感染的診斷和治療提供新依據(jù)。
[Abstract]:Objective: RNA (microRNA, miRNA) is a kind of non coding regulatory single strand small molecule RNA, which can be combined with specific target mRNA through base pairs to regulate the target gene after transcriptional level. In recent years, the research shows that miRNA not only participates in the regulation of normal cell function, but also the role of the virus and the host and the replication of the virus. The herpes simplex virus type I (Herpes simpleX virus type 1, HSV-1) is a DNA virus that can cause diseases such as lip herpes and lurk in the trigeminal ganglion. The herpes virus itself has been found to be able to codec miRNA, and its expression changes from the virus to the virus. The reproduction of the body has a certain effect, but the relationship between the host miRNA and the virus replication is not very clear. The purpose of this study is to explore whether the host miRNA participates in the regulation process of the virus replication. This regulation process is realized through which genes. First, after overexpressing and blocking the miR-101 in the HeLa cells, the virus drops are used. The plaque formation experiment and real-time PCR were used to detect the changes in the replication ability of the virus. Then the candidate target genes of miR-101 were screened by bioinformatics, and the direct regulation of miR-101 on the target gene was verified by the fluorescence report carrier experiment. The real-time PCR and Western blot experimental techniques were used to detect the mRN of the target gene to the target gene. The expression changes of A and protein levels. Then overexpress the full length of the target gene, carry out the rescue experiment, further verify the regulatory role of miR-101 on the target gene. After the target gene was knocked out by RNA interference technique, the effect of the target base on the replication of the virus was examined by the virus titrated plaque formation experiment and the real-time PCR test. The function of the target gene. Finally, real-time PCR was used to detect the expression level of miR-101 and ATP5B in HSV-1 infected HeLa cells. Results: in HeLa cells, the replication of the virus was obviously inhibited after the miR-101 was overexpressed, the formation of the virus's plaque was obviously reduced and the level of the virus DNA polymerase gene decreased obviously. After closed miR-101, the virus was closed to the virus. The replication enhancement, the level of the virus DNA polymerase gene also increased. Target gene screening results showed that ATP5B was a candidate target gene for miR-101, and its 3'non translation region contained miR-101 potential binding site. The fluorescence report carrier experiment confirmed that miR-101 could negatively regulate its expression through the 3' non translation region acting on the ATP5B gene. The overexpression of miR-101 in La cells, the level of mRNA and protein in ATP5B decreased significantly, and the mRNA and protein level of ATP5B increased after blocking miR-101. In addition, the overexpression of the ATP5B gene without 3'UTR could weaken the inhibitory effect of miR-101 on the proliferation of the virus, and the replication ability of the virus was restored. The formation and DNA content of the virus decreased significantly, consistent with the overexpressed miR-101. After HSV-1 infection of HeLa cells, the level of miR-101 gradually increased with the prolongation of the infection time, the level of the target gene ATP5B gradually decreased, and the two had a negative correlation. Conclusion: miRNA is an endogenous molecule regulating the level of the cell gene after transcription, and participates in the modulation. The interaction between virus control and host cells. This study for the first time found that the host cell encoded miR-101 has the antiviral effect of.MiR-101 by reducing the expression of the target gene ATP5B and inhibiting the proliferation of HSV-1 in HeLa cells. After HSV-1 infection of HeLa cells, the level of miR-101 gradually increases, and the level of the target gene ATP5B gradually decreases, indicating HSV-1. For the first time, the regulation of miR-101 and its target gene on HSV-1 replication can be maintained by inhibiting the miRNA antiviral effect of the host. It is beneficial for us to understand the occurrence and development of the virus infection and provide new evidence for the diagnosis and treatment of virus infection.

【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號】：R373

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本文編號：1838641