本文選題：氨基胍 + 轉(zhuǎn)化生長因子　； 參考：《河北醫(yī)科大學(xué)》2012年碩士論文

【摘要】：目的：肺纖維化（pulmonary fibrosis，PF）是一種由多種因素引起的肺間質(zhì)性病變。肺纖維化時(shí)，肺間質(zhì)中的膠原纖維大多由肌成纖維細(xì)胞(Myofibroblast,MFb)合成。肌成纖維細(xì)胞是以表達(dá)-平滑肌肌動(dòng)蛋白(smooth musle actin,-SMA)為標(biāo)志的成纖維細(xì)胞。氨基胍(aminoguanidine,AG)是誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（inducible nitric oxidesynthase,iNOS)抑制劑；1400W是一種選擇性較強(qiáng)的高效iNOS抑制劑。AG或1400W對于離體肺成纖維細(xì)胞結(jié)締組織生長因子(connective tissuegrowth factor,CTGF)及肌成纖維細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化的影響目前尚未見報(bào)道。RNA干擾（RNA interference,RNAi）作為一種新興的基因水平調(diào)控技術(shù)，通過合成特異性小干擾RNA（small interfering RNA,siRNA）沉默靶基因的表達(dá),已成為基因功能研究和基因治療的全新手段。因此，本實(shí)驗(yàn)通過離體觀察AG和1400W對大鼠肺成纖維細(xì)胞CTGF及-SMA蛋白表達(dá)的影響；并利用CTGF siRNA技術(shù)闡明AG和1400W對肺成纖維細(xì)胞CTGF及肌成纖維細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化影響的機(jī)制，為評價(jià)iNOS抑制劑在肺纖維化防治中的作用提供資料。 方法:體外分離培養(yǎng)原代雄性SD大鼠(130-150g)肺成纖維細(xì)胞；MTT法測定AG和1400W對肺成纖維細(xì)胞存活率的影響；Western Blot法測定肺成纖維細(xì)胞CTGF及-SMA的蛋白表達(dá)。 結(jié)果： 1TGF-誘導(dǎo)肺成纖維細(xì)胞CTGF蛋白表達(dá)的最佳時(shí)間點(diǎn) 基礎(chǔ)狀態(tài)的肺成纖維細(xì)胞是指正常培養(yǎng)的肺成纖維細(xì)胞。與相應(yīng)的對照組相比，24h、48h、72h CTGF的表達(dá)均上調(diào)（P＜0.01），與24h、72h時(shí)間點(diǎn)相比，48h時(shí)間點(diǎn)上調(diào)更明顯（P＜0.05）。因此，本實(shí)驗(yàn)將48h定為TGF-誘導(dǎo)基礎(chǔ)狀態(tài)的肺成纖維細(xì)胞CTGF蛋白表達(dá)的最佳時(shí)間點(diǎn)。 TGF-處理后的細(xì)胞是指經(jīng)TGF-(10ng/ml)刺激48h的肺成纖維細(xì)胞。與相應(yīng)的對照組相比，TGF-誘導(dǎo)24h、48h、72h時(shí)TGF-處理后的肺成纖維細(xì)胞CTGF蛋白表達(dá)均上調(diào)（P＜0.05, P＜0.01）。 2不同濃度的AG和1400W對基礎(chǔ)狀態(tài)及TGF-處理后的肺成纖維細(xì)胞存活率的影響 與對照組相比，1mmol/L AG對兩種狀態(tài)的肺成纖維細(xì)胞的作用均無無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），而當(dāng)AG濃度達(dá)到5mmol/L、10mmol/L、20mmol/L、30mmol/L、40mmol/L或50mmol/L時(shí)，其存活率顯著增高（P＜0.01，P＜0.001）。 與對照組相比，1400W隨濃度變化對兩種狀態(tài)的肺成纖維細(xì)胞存活率的影響均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。 3AG和1400W對肺成纖維細(xì)胞CTGF及-SMA蛋白表達(dá)的影響 3.1不同濃度的AG和1400W對基礎(chǔ)狀態(tài)的肺成纖維細(xì)胞CTGF蛋白及-SMA表達(dá)的影響 與對照組相比，，0.1mmol/L的AG對基礎(chǔ)狀態(tài)的肺成纖維細(xì)胞CTGF及-SMA蛋白表達(dá)無顯著性差異（P＞0.05）,1mmol/L的AG明顯上調(diào)CTGF及-SMA蛋白表達(dá)（P＜0.01），而10mmol/L、20mmol/L、30mmol/L的AG則劑量依賴性下調(diào)肺成纖維細(xì)胞的CTGF及-SMA蛋白表達(dá)（P＜0.05,P＜0.01）。說明低濃度AG（1mmol/L）誘導(dǎo)基礎(chǔ)狀態(tài)的肺成纖維細(xì)胞CTGF及-SMA蛋白表達(dá)上調(diào)，而高濃度AG（10mmol/L、20mmol/L、30mmol/L）抑制其表達(dá)。 與對照組相比，20nmol/L的1400W明顯上調(diào)肺成纖維細(xì)胞CTGF及-SMA蛋白表達(dá)（P＜0.05），40nmol/L和80nmol/L均無顯著性差異（P＞0.05）,160nmol/L顯著下調(diào)其表達(dá)（P＜0.05）。說明低濃度1400W（20nmol/L）誘導(dǎo)基礎(chǔ)狀態(tài)的肺成纖維細(xì)胞CTGF及-SMA蛋白表達(dá)上調(diào)，而高濃度1400W（160nmol/L）抑制其表達(dá)。 3.2不同時(shí)間點(diǎn)AG和1400W對基礎(chǔ)狀態(tài)的肺成纖維細(xì)胞CTGF及-SMA蛋白表達(dá)的影響 與相應(yīng)的對照組相比，AG（1mmol/L）24h肺成纖維細(xì)胞CTGF及-SMA蛋白表達(dá)上調(diào)無顯著性差異（P＞0.05），48h、72h CTGF蛋白表達(dá)均上調(diào)（P＜0.001，P＜0.05）,48h、72h-SMA蛋白表達(dá)均明顯上調(diào)（P＜0.01,P＜0.05）。與72h時(shí)間點(diǎn)相比，48h時(shí)間點(diǎn)CTGF及-SMA蛋白表達(dá)上調(diào)更明顯（P＜0.01，P＜0.05）,因此，本實(shí)驗(yàn)將48h定為AG（1mmol/L）對肺成纖維細(xì)胞CTGF及-SMA蛋白表達(dá)的最佳時(shí)間點(diǎn)。 與相應(yīng)的對照組相比，1400W（20nmol/L）24h、48h CTGF及-SMA蛋白表達(dá)均上調(diào)（P＜0.05，P＜0.01），72h時(shí)間點(diǎn)無明顯變化（P＞0.05）。與24h時(shí)間點(diǎn)相比，48h CTGF及-SMA蛋白表達(dá)上調(diào)更明顯（P＜0.05）。因此，48h CTGF及-SMAF蛋白表達(dá)上調(diào)最明顯。 4不同濃度的AG和1400W對TGF-處理的肺成纖維細(xì)胞CTGF及-SMA蛋白表達(dá)的影響 與基礎(chǔ)狀態(tài)的肺成纖維細(xì)胞組相比，TGF-處理組CTGF及-SMA蛋白表達(dá)均上調(diào)（P＜0.01）。與TGF-處理組相比，TGF-+AG(1mmol/L)組CTGF及-SMA蛋白表達(dá)無顯著差異（P＞0.05），TGF-+AG（10mmol/L、20mmol/L、30mmol/L）則劑量依賴性下調(diào)肺成纖維細(xì)胞CTGF及-SMA蛋白表達(dá)(P＜0.05,P＜0.01）。說明低濃度1mmol/L AG對TGF-處理的肺成纖維細(xì)胞CTGF及-SMA蛋白表達(dá)無明顯影響，高濃度10mmol/L、20mmol/L、30mmol/L AG抑制其表達(dá)。 與基礎(chǔ)狀態(tài)細(xì)胞組相比，TGF-處理組CTGF及-SMA蛋白表達(dá)明顯上調(diào)（P＜0.01）。與TGF-組相比，TGF-+1400W(10nmol/L、20nmol/L)組CTGF及-SMA蛋白表達(dá)無顯著性差異（P＞0.05），TGF-+1400W(40nmol/L、80nmol/L)組抑制CTGF及-SMA蛋白表達(dá)（P＜0.05,P＜0.01）。 5抑制效果最佳的CTGF siRNA特異靶序列的篩選 與NC siRNA相比，6737siRNA組CTGF和-SMA的表達(dá)均有所下調(diào)(P＜0.01,P＜0.05），6738siRNA組CTGF和-SMA的表達(dá)下調(diào)(P＜0.05），兩組對CTGF抑制率分別為（425）%、(294)%。以6737siRNA下調(diào)最明顯（P＜0.01）。說明6737siRNA對CTGF的抑制效果最佳。 6CTGF-siRNA對AG或1400W誘導(dǎo)的肺成纖維細(xì)胞CTGF及-SMA蛋白表達(dá)的影響 與NC組相比,6737siRNA下調(diào)CTGF及-SMA蛋白表達(dá)(P＜0.05）。與AG(1mmol/L)組相比，AG+NC組對CTGF及-SMA蛋白表達(dá)無明顯影響（P＞0.05）。與AG+NC組相比，AG+6737siRNA組CTGF及-SMA蛋白表達(dá)明顯下調(diào)(P＜0.01）,AG+6738siRNA組CTGF及-SMA蛋白下調(diào)（P＜0.05）。說明6737siRNA、6738siRNA對AG誘導(dǎo)的CTGF的表達(dá)均有抑制作用，抑制率分別為（416）%、(244)%，并導(dǎo)致-SMA蛋白表達(dá)下調(diào)。 與1400W+NC組相比，1400W+6737siRNA組和1400W+6738siRNA組CTGF及-SMA蛋白表達(dá)均明顯下調(diào)(P＜0.01,P＜0.05）。 結(jié)論： 1低濃度的AG（1mmol/L）和1400W(20nmol/L)可誘導(dǎo)基礎(chǔ)狀態(tài)的肺成纖維細(xì)胞CTGF蛋白表達(dá)，并促進(jìn)肌成纖維細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化；而高濃度AG (10mmol/L、20mmol/L、30mmol/L)和1400W(160nmol/L)可下調(diào)肺成纖維細(xì)胞CTGF及-SMA蛋白表達(dá)。 2低濃度的AG（1mmol/L）和1400W(20nmol/L)對TGF-誘導(dǎo)的肺成纖維細(xì)胞CTGF及-SMA蛋白表達(dá)無明顯影響；高濃度的AG (10mmol/L、20mmol/L、30mmol/L)抑制其表達(dá)。 3CTGF siRNA可阻斷AG(1mmol/L）和1400W(20nmol/L)誘導(dǎo)的肺成纖維細(xì)胞CTGF蛋白表達(dá)上調(diào)，并導(dǎo)致-SMA蛋白表達(dá)下調(diào)。說明CTGF蛋白表達(dá)的下調(diào)阻礙了肺肌成纖維細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化。
[Abstract]:Objective: pulmonary fibrosis (PF) is a pulmonary interstitial lesion caused by a variety of factors. During pulmonary fibrosis, the collagen fibers in the pulmonary interstitium are mostly synthesized by Myofibroblast (MFb). Myofibroblast is a fibroblast characterized by the expression of smooth musle actin (-SMA). Aminoguanidine (aminoguanidine, AG) is an inhibitor of inducible nitric oxide synthase (inducible nitric oxidesynthase, iNOS), and 1400W is a highly selective and highly efficient iNOS inhibitor.AG or 1400W for the transformation of connective tissue growth factor (connective tissuegrowth) and myofibroblast in isolated lung fibroblasts. .RNA interference (RNA interference, RNAi) has not been reported as a new gene level regulation technique, which has become a new means of gene function research and gene therapy by synthesizing specific small interference RNA (small interfering RNA, siRNA) silent target gene. Therefore, this experiment is made by observing AG and 1400W in vitro. The effect of CTGF and -SMA protein expression in rat lung fibroblasts, and the mechanism of the effect of AG and 1400W on the phenotypic transformation of pulmonary fibroblasts CTGF and myofibroblast by CTGF siRNA technique, and to provide information for evaluating the role of iNOS inhibitors in the prevention and treatment of pulmonary fibrosis.
Methods: the primary male SD rat (130-150g) lung fibroblasts were isolated and cultured in vitro, and the effect of AG and 1400W on the survival rate of lung fibroblasts was measured by MTT, and the protein expression of CTGF and -SMA in lung fibroblasts was measured by Western Blot.
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本文編號：1829956