本文選題：氨基胍 + 轉化生長因子　； 參考：《河北醫(yī)科大學》2012年碩士論文

【摘要】：目的：肺纖維化（pulmonary fibrosis，PF）是一種由多種因素引起的肺間質性病變。肺纖維化時，肺間質中的膠原纖維大多由肌成纖維細胞(Myofibroblast,MFb)合成。肌成纖維細胞是以表達-平滑肌肌動蛋白(smooth musle actin,-SMA)為標志的成纖維細胞。氨基胍(aminoguanidine,AG)是誘導型一氧化氮合酶（inducible nitric oxidesynthase,iNOS)抑制劑；1400W是一種選擇性較強的高效iNOS抑制劑。AG或1400W對于離體肺成纖維細胞結締組織生長因子(connective tissuegrowth factor,CTGF)及肌成纖維細胞表型轉化的影響目前尚未見報道。RNA干擾（RNA interference,RNAi）作為一種新興的基因水平調控技術，通過合成特異性小干擾RNA（small interfering RNA,siRNA）沉默靶基因的表達,已成為基因功能研究和基因治療的全新手段。因此，本實驗通過離體觀察AG和1400W對大鼠肺成纖維細胞CTGF及-SMA蛋白表達的影響；并利用CTGF siRNA技術闡明AG和1400W對肺成纖維細胞CTGF及肌成纖維細胞表型轉化影響的機制，為評價iNOS抑制劑在肺纖維化防治中的作用提供資料。 方法:體外分離培養(yǎng)原代雄性SD大鼠(130-150g)肺成纖維細胞；MTT法測定AG和1400W對肺成纖維細胞存活率的影響；Western Blot法測定肺成纖維細胞CTGF及-SMA的蛋白表達。 結果： 1TGF-誘導肺成纖維細胞CTGF蛋白表達的最佳時間點 基礎狀態(tài)的肺成纖維細胞是指正常培養(yǎng)的肺成纖維細胞。與相應的對照組相比，24h、48h、72h CTGF的表達均上調（P＜0.01），與24h、72h時間點相比，48h時間點上調更明顯（P＜0.05）。因此，本實驗將48h定為TGF-誘導基礎狀態(tài)的肺成纖維細胞CTGF蛋白表達的最佳時間點。 TGF-處理后的細胞是指經TGF-(10ng/ml)刺激48h的肺成纖維細胞。與相應的對照組相比，TGF-誘導24h、48h、72h時TGF-處理后的肺成纖維細胞CTGF蛋白表達均上調（P＜0.05, P＜0.01）。 2不同濃度的AG和1400W對基礎狀態(tài)及TGF-處理后的肺成纖維細胞存活率的影響 與對照組相比，1mmol/L AG對兩種狀態(tài)的肺成纖維細胞的作用均無無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），而當AG濃度達到5mmol/L、10mmol/L、20mmol/L、30mmol/L、40mmol/L或50mmol/L時，其存活率顯著增高（P＜0.01，P＜0.001）。 與對照組相比，1400W隨濃度變化對兩種狀態(tài)的肺成纖維細胞存活率的影響均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。 3AG和1400W對肺成纖維細胞CTGF及-SMA蛋白表達的影響 3.1不同濃度的AG和1400W對基礎狀態(tài)的肺成纖維細胞CTGF蛋白及-SMA表達的影響 與對照組相比，，0.1mmol/L的AG對基礎狀態(tài)的肺成纖維細胞CTGF及-SMA蛋白表達無顯著性差異（P＞0.05）,1mmol/L的AG明顯上調CTGF及-SMA蛋白表達（P＜0.01），而10mmol/L、20mmol/L、30mmol/L的AG則劑量依賴性下調肺成纖維細胞的CTGF及-SMA蛋白表達（P＜0.05,P＜0.01）。說明低濃度AG（1mmol/L）誘導基礎狀態(tài)的肺成纖維細胞CTGF及-SMA蛋白表達上調，而高濃度AG（10mmol/L、20mmol/L、30mmol/L）抑制其表達。 與對照組相比，20nmol/L的1400W明顯上調肺成纖維細胞CTGF及-SMA蛋白表達（P＜0.05），40nmol/L和80nmol/L均無顯著性差異（P＞0.05）,160nmol/L顯著下調其表達（P＜0.05）。說明低濃度1400W（20nmol/L）誘導基礎狀態(tài)的肺成纖維細胞CTGF及-SMA蛋白表達上調，而高濃度1400W（160nmol/L）抑制其表達。 3.2不同時間點AG和1400W對基礎狀態(tài)的肺成纖維細胞CTGF及-SMA蛋白表達的影響 與相應的對照組相比，AG（1mmol/L）24h肺成纖維細胞CTGF及-SMA蛋白表達上調無顯著性差異（P＞0.05），48h、72h CTGF蛋白表達均上調（P＜0.001，P＜0.05）,48h、72h-SMA蛋白表達均明顯上調（P＜0.01,P＜0.05）。與72h時間點相比，48h時間點CTGF及-SMA蛋白表達上調更明顯（P＜0.01，P＜0.05）,因此，本實驗將48h定為AG（1mmol/L）對肺成纖維細胞CTGF及-SMA蛋白表達的最佳時間點。 與相應的對照組相比，1400W（20nmol/L）24h、48h CTGF及-SMA蛋白表達均上調（P＜0.05，P＜0.01），72h時間點無明顯變化（P＞0.05）。與24h時間點相比，48h CTGF及-SMA蛋白表達上調更明顯（P＜0.05）。因此，48h CTGF及-SMAF蛋白表達上調最明顯。 4不同濃度的AG和1400W對TGF-處理的肺成纖維細胞CTGF及-SMA蛋白表達的影響 與基礎狀態(tài)的肺成纖維細胞組相比，TGF-處理組CTGF及-SMA蛋白表達均上調（P＜0.01）。與TGF-處理組相比，TGF-+AG(1mmol/L)組CTGF及-SMA蛋白表達無顯著差異（P＞0.05），TGF-+AG（10mmol/L、20mmol/L、30mmol/L）則劑量依賴性下調肺成纖維細胞CTGF及-SMA蛋白表達(P＜0.05,P＜0.01）。說明低濃度1mmol/L AG對TGF-處理的肺成纖維細胞CTGF及-SMA蛋白表達無明顯影響，高濃度10mmol/L、20mmol/L、30mmol/L AG抑制其表達。 與基礎狀態(tài)細胞組相比，TGF-處理組CTGF及-SMA蛋白表達明顯上調（P＜0.01）。與TGF-組相比，TGF-+1400W(10nmol/L、20nmol/L)組CTGF及-SMA蛋白表達無顯著性差異（P＞0.05），TGF-+1400W(40nmol/L、80nmol/L)組抑制CTGF及-SMA蛋白表達（P＜0.05,P＜0.01）。 5抑制效果最佳的CTGF siRNA特異靶序列的篩選 與NC siRNA相比，6737siRNA組CTGF和-SMA的表達均有所下調(P＜0.01,P＜0.05），6738siRNA組CTGF和-SMA的表達下調(P＜0.05），兩組對CTGF抑制率分別為（425）%、(294)%。以6737siRNA下調最明顯（P＜0.01）。說明6737siRNA對CTGF的抑制效果最佳。 6CTGF-siRNA對AG或1400W誘導的肺成纖維細胞CTGF及-SMA蛋白表達的影響 與NC組相比,6737siRNA下調CTGF及-SMA蛋白表達(P＜0.05）。與AG(1mmol/L)組相比，AG+NC組對CTGF及-SMA蛋白表達無明顯影響（P＞0.05）。與AG+NC組相比，AG+6737siRNA組CTGF及-SMA蛋白表達明顯下調(P＜0.01）,AG+6738siRNA組CTGF及-SMA蛋白下調（P＜0.05）。說明6737siRNA、6738siRNA對AG誘導的CTGF的表達均有抑制作用，抑制率分別為（416）%、(244)%，并導致-SMA蛋白表達下調。 與1400W+NC組相比，1400W+6737siRNA組和1400W+6738siRNA組CTGF及-SMA蛋白表達均明顯下調(P＜0.01,P＜0.05）。 結論： 1低濃度的AG（1mmol/L）和1400W(20nmol/L)可誘導基礎狀態(tài)的肺成纖維細胞CTGF蛋白表達，并促進肌成纖維細胞表型轉化；而高濃度AG (10mmol/L、20mmol/L、30mmol/L)和1400W(160nmol/L)可下調肺成纖維細胞CTGF及-SMA蛋白表達。 2低濃度的AG（1mmol/L）和1400W(20nmol/L)對TGF-誘導的肺成纖維細胞CTGF及-SMA蛋白表達無明顯影響；高濃度的AG (10mmol/L、20mmol/L、30mmol/L)抑制其表達。 3CTGF siRNA可阻斷AG(1mmol/L）和1400W(20nmol/L)誘導的肺成纖維細胞CTGF蛋白表達上調，并導致-SMA蛋白表達下調。說明CTGF蛋白表達的下調阻礙了肺肌成纖維細胞表型轉化。
[Abstract]:Objective: pulmonary fibrosis (PF) is a pulmonary interstitial lesion caused by a variety of factors. During pulmonary fibrosis, the collagen fibers in the pulmonary interstitium are mostly synthesized by Myofibroblast (MFb). Myofibroblast is a fibroblast characterized by the expression of smooth musle actin (-SMA). Aminoguanidine (aminoguanidine, AG) is an inhibitor of inducible nitric oxide synthase (inducible nitric oxidesynthase, iNOS), and 1400W is a highly selective and highly efficient iNOS inhibitor.AG or 1400W for the transformation of connective tissue growth factor (connective tissuegrowth) and myofibroblast in isolated lung fibroblasts. .RNA interference (RNA interference, RNAi) has not been reported as a new gene level regulation technique, which has become a new means of gene function research and gene therapy by synthesizing specific small interference RNA (small interfering RNA, siRNA) silent target gene. Therefore, this experiment is made by observing AG and 1400W in vitro. The effect of CTGF and -SMA protein expression in rat lung fibroblasts, and the mechanism of the effect of AG and 1400W on the phenotypic transformation of pulmonary fibroblasts CTGF and myofibroblast by CTGF siRNA technique, and to provide information for evaluating the role of iNOS inhibitors in the prevention and treatment of pulmonary fibrosis.
Methods: the primary male SD rat (130-150g) lung fibroblasts were isolated and cultured in vitro, and the effect of AG and 1400W on the survival rate of lung fibroblasts was measured by MTT, and the protein expression of CTGF and -SMA in lung fibroblasts was measured by Western Blot.
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本文編號：1829956