本文選題：CD14+單核細(xì)胞 + 破骨細(xì)胞�。� 參考：《中南大學(xué)》2011年博士論文

【摘要】：第一部分人外周血單核細(xì)胞向破骨細(xì)胞分化過(guò)程中microRNA表達(dá)譜的研究 目的：誘導(dǎo)人外周血單核細(xì)胞向破骨細(xì)胞分化,研究在人外周血單核細(xì)胞向破骨細(xì)胞分化過(guò)程中microRNA表達(dá)譜的變化。 方法：采用密度梯度離心法從外周血分離單個(gè)核細(xì)胞貼壁培養(yǎng),用免疫磁珠法分選出高純度的CD14+外周血單核細(xì)胞(Peripheral Blood Mononuclear Cells, PBMCs);使用重組人巨噬細(xì)胞集落刺激因子(recombinant human-macrophage colony stimulating factor, rh-MCSF)和人核因子κB受體活化素配體(human receptor activator of nuclear factor-κB ligand, hRANKL)誘導(dǎo)CD14+PBMCs向破骨細(xì)胞分化,抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate-resistant acid phosphatase, TRAP)染色和骨吸收陷窩實(shí)驗(yàn)觀察破骨細(xì)胞的分化成熟情況。建立成熟的誘導(dǎo)人外周血單核細(xì)胞向破骨細(xì)胞分化的細(xì)胞模型。應(yīng)用miRNA微陣列技術(shù),分析人外周血單核細(xì)胞向破骨細(xì)胞分化過(guò)程中miRNA表達(dá)譜的變化。通過(guò)qRT-PCR方法驗(yàn)證表達(dá)明顯變化的miRNA在CD 14+PBMCs向破骨細(xì)胞分化過(guò)程中的表達(dá)情況。選取表達(dá)顯著增高的miR-148a作為進(jìn)一步的研究對(duì)象。 結(jié)果：(1)采用密度梯度離心法成功從人外周血中分離出單核細(xì)胞,并利用MACS磁珠分選系統(tǒng)分選出高純度的CD14+PBMCs; (2)rh-MCSF和hRANKL誘導(dǎo)C14+PBMCs培養(yǎng)至14天后,可見(jiàn)TRAP染色陽(yáng)性的多核巨細(xì)胞形成,甲苯胺藍(lán)染色可見(jiàn)骨吸收陷窩形成；(3)用miRNA microarray芯片檢測(cè)CD14+PBMCs向破骨細(xì)胞分化過(guò)程中miRNA表達(dá)譜變化,發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)的miRNA有27個(gè),表達(dá)明顯上調(diào)的有5個(gè),分別是：hsa-miR-148a, hsa-miR-483, hsa-miR-223, hsa-miR-21, hsa-miR-214;表達(dá)明顯下調(diào)的有4個(gè),分別是：hsa-miR-155, hsa-miR-125a, hsa-miR-27b, hsa-miR-145以hsa-miR-148a表達(dá)上調(diào)最為明顯。(4)對(duì)明顯差異表達(dá)的miRNA進(jìn)一步行實(shí)時(shí)定量RT-PCR驗(yàn)證,發(fā)現(xiàn)定量PCR結(jié)果與芯片結(jié)果一致,表明miRNA芯片結(jié)果是可靠的。 結(jié)論：建立了成熟的誘導(dǎo)人CD 14+PBMCs向破骨細(xì)胞分化的細(xì)胞模型。應(yīng)用microRNA芯片發(fā)現(xiàn)CD 14+PBMCs向破骨細(xì)胞分化過(guò)程中,hsa-miR-148a, hsa-miR-483, hsa-miR-223, hsa-miR-21, hsa-miR-214表達(dá)明顯上調(diào),而hsa-miR-155, hsa-miR-125a, hsa-miR-27b, hsa-miR-145表達(dá)明顯下調(diào)。以hsa-miR-148a表達(dá)上調(diào)最為顯著。 第二部分miR-148a對(duì)破骨細(xì)胞分化的功能研究 目的：研究hsa-miR-148a在CD14+PBMCs向破骨細(xì)胞分化過(guò)程中的作用。 方法：用rh-MCSF和hRANKL誘導(dǎo)CD14+PBMCs向破骨細(xì)胞分化,Northern印跡雜交檢測(cè)hsa-miR-148a在此過(guò)程中的表達(dá)模式。根據(jù)hsa-miR-148a前體序列設(shè)計(jì)引物,用pSilencer 4.1-CMV puro合成hsa-miR-148a表達(dá)載體pre-miR-148a。將pre-miR-148a轉(zhuǎn)染PBMCs,構(gòu)建pre-miR-148a過(guò)表達(dá)細(xì)胞模型,轉(zhuǎn)染后加入rh-MCSF和hRANKL誘導(dǎo)分化, Northern雜交檢測(cè)hsa-miR-148a表達(dá)變化,TRAP染色及骨吸收陷窩觀察破骨細(xì)胞分化情況,實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)破骨細(xì)胞分化指標(biāo)TRAP、NFATc 1 (nuclear factor of activated T cells c1,活化T細(xì)胞核因子c1)、OSCAR (osteoclast-associated receptor,破骨細(xì)胞相關(guān)受體)、CathK (Cathepsin K,組織激酶K) mRNA水平,Western印跡雜交檢測(cè)TRAP蛋白表達(dá)水平。用2'-O-methyl修飾的反義寡核苷酸anti-miR-148a轉(zhuǎn)染PBMCs,構(gòu)建pre-miR-148a表達(dá)降低細(xì)胞模型,同樣行TRAP染色及骨吸收陷窩實(shí)驗(yàn),實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)TRAP、NFATc1、OSCAR、CathK mRNA水平,Western印跡雜交檢測(cè)TRAP蛋白表達(dá)水平。 結(jié)果：(1)rh-MCSF和hRANKL誘導(dǎo)CD14+PBMCs向破骨細(xì)胞分化過(guò)程中,隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng),hsa-miR-148a表達(dá)逐漸增多。(2)用pSilencer 4.1-CMV puro成功構(gòu)建hsa-miR-148a表達(dá)載體pre-miR-148a,能在細(xì)胞中高表達(dá)hsa-miR-148a。(3) hsa-miR-148a過(guò)表達(dá)能促進(jìn)TRAP陽(yáng)性多核巨細(xì)胞形成和骨吸收陷窩形成,提高破骨細(xì)胞分化指標(biāo)TRAP、NFATc1、OSCAR、CathK mRNA水平,提高TRAP蛋白表達(dá)水平。(4)抑制hsa-miR-148a能抑制TRAP陽(yáng)性多核巨細(xì)胞形成和骨吸收陷窩形成,降低TRAP、NFATc1、OSCAR、CathK mRNA水平,降低TRAP蛋白表達(dá)水平。 結(jié)論：構(gòu)建了hsa-miR-148a表達(dá)載體,過(guò)表達(dá)hsa-miR-148a可以促進(jìn)CD14+PBMCs向破骨細(xì)胞分化,而抑制hsa-miR-148a則延緩CD14+PBMCs向破骨細(xì)胞分化。 第三部分hsa-miR-148a調(diào)控破骨細(xì)胞分化的機(jī)制研究 目的：預(yù)測(cè)并驗(yàn)證hsa-miR-148a作用的靶基因,闡明hsa-miR-148a調(diào)控CD14+PBMCs向破骨細(xì)胞分化的作用機(jī)制。 方法：用TargetScan和PicTar等靶基因預(yù)測(cè)軟件分析得到hsa-miR-148a作用的靶基因。將含有hsa-miR-148a結(jié)合位點(diǎn)的靶基因MAFB (V-maf musculoaponeurotic fibrosarcoma oncogene homolog B, V-maf肌腱膜纖維肉瘤癌基因同源物B)3'UTR片段克隆到pGL3載體的3'UTR區(qū),構(gòu)建野生型報(bào)告載體WT-pGL3-MAFB-3'UTR。同時(shí)我們用QuickChange site-directed mutagenesis試劑盒構(gòu)建了含有突變靶位點(diǎn)的突變型報(bào)告載體MUT-pGL3-MAFB-3'UTR。將這兩個(gè)載體分別與pre-miR-148a或miR-C共同轉(zhuǎn)染PBMCs,檢測(cè)熒光素酶活性變化以證實(shí)該靶基因是否為hsa-miR-148a作用的靶基因。PBMCs單獨(dú)轉(zhuǎn)染pre-miR-148a, Western雜交和實(shí)時(shí)定量PCR分別檢測(cè)靶基因MAFB蛋白和mRNA水平的變化,明確hsa-miR-148a對(duì)靶基因的調(diào)控作用。PCR擴(kuò)增MAFB CDS全長(zhǎng)片段,連接到pcDNA3.1(+)載體構(gòu)建野生型靶基因表達(dá)載體,同時(shí)構(gòu)建了含有突變靶位點(diǎn)的突變型靶基因表達(dá)載體。將這兩個(gè)載體分別與pre-miR-148a或miR-C共同轉(zhuǎn)染PBMCs,實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)TRAP mRNA水平,靶基因蛋白表達(dá)用Western雜交檢測(cè)。 結(jié)果：(1)TargetScan和PicTar等靶基因預(yù)測(cè)軟件預(yù)測(cè)MAFB為hsa-miR-148a作用的靶基因。(2)與轉(zhuǎn)染miR-C對(duì)照組相比,pre-miR-148a和WT-pGL3-MAFB-3'UTR共轉(zhuǎn)染組的熒光素酶活性受到明顯的抑制,而pre-miR-148a和MUT-pGL3-MAFB-3'UTR共轉(zhuǎn)染組的熒光素酶活性則無(wú)明顯變化。(3)單獨(dú)轉(zhuǎn)染pre-miR-148a可以降低MAFB蛋白水平,而對(duì)MAFBmRNA水平無(wú)影響。(4)pre-miR-148a與WT-pcDNA3.1-MAFB共同轉(zhuǎn)染能增加TRAP mRNA水平,降低MAFB蛋白表達(dá)水平；而pre-miR-148a與MUT-pcDNA3.1-MAFB共同轉(zhuǎn)染不能增加TRAP mRNA水平,對(duì)MAFB蛋白水平?jīng)]有影響。因此,我們認(rèn)為hsa-miR-148a主要通過(guò)抑制MAFB蛋白表達(dá)來(lái)促進(jìn)破骨細(xì)胞分化。 結(jié)論：(1)構(gòu)建了野生型和突變型MAFB 3'UTR熒光素酶報(bào)告基因載體、野生型和突變型MAFB表達(dá)載體。(2)通過(guò)靶基因預(yù)測(cè)軟件預(yù)測(cè)并經(jīng)熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)證實(shí)MAFB為hsa-miR-148a作用的靶基因。(3)hsa-miR-148a在轉(zhuǎn)錄后水平抑制MAFB表達(dá),促進(jìn)破骨細(xì)胞分化。(4)MAFB是hsa-miR-148a調(diào)控破骨細(xì)胞分化過(guò)程中最重要的靶基因。
[Abstract]:Study on microRNA expression profile during the differentiation of peripheral blood mononuclear cells from the first part of human peripheral blood mononuclear cells


Objective : To induce differentiation of human peripheral blood mononuclear cells ( PBMC ) from peripheral blood mononuclear cells ( PBMC ) and to investigate the changes of microRNA expression profiles in human peripheral blood mononuclear cells ( PBMC ) .


Methods : Peripheral blood mononuclear cells ( PBMCs ) were isolated from peripheral blood by density gradient centrifugation , and high - purity CD14 + peripheral blood mononuclear cells ( PBMCs ) were separated by immunomagnetic beads . The expression of miRNA expression profiles in human peripheral blood mononuclear cells ( PBMC ) was analyzed by using miRNA microarray technology .


Results : ( 1 ) Monocyte was isolated from human peripheral blood by density gradient centrifugation , and high purity CD14 + PBMCs were separated by MACS magnetic bead sorting system .
( 3 ) The expression profiles of miRNA in CD14 + PBMCs were detected by miRNA microarray . There were 27 miRNA expression profiles , respectively : hsa - miR - 148a , hsa - miR - 483 , hsa - miR - 223 , hsa - miR - 21 , hsa - miR - 214 ; the expression of hsa - miR - 1 , hsa - miR - 27b , hsa - miR - 145 was up - regulated in hsa - miR - 148a .


Conclusion : The expression of hsa - miR - 148a , hsa - miR - 483 , hsa - miR - 223 , hsa - miR - 21 , hsa - miR - 214 was significantly up - regulated during the differentiation of CD 14 + PBMCs from CD 14 + PBMCs by microRNA chip , while hsa - miR - 155 , hsa - miR - 125a , hsa - miR - 27b and hsa - miR - 145 were downregulated .


The Functional Study of the Second Part of miR - 148a on Osteoclasts Differentiation


Objective : To study the role of hsa - miR - 148a in the differentiation process of CD14 + PBMCs .


Methods : The pre - miR - 148a expression vector pre - miR - 148a was transfected into PBMCs by using the antisense oligonucleotides of hsa - miR - 148a to construct pre - miR - 148a expression vector pre - miR - 148a .


Results : ( 1 ) The expression of hsa - miR - 148a increased gradually with the increase of induction time . ( 2 ) hsa - miR - 148a expression vector pre - miR - 148a was successfully constructed by ptimi4.1 - CMV puro .


Conclusion : hsa - miR - 148a expression vector was constructed . hsa - miR - 148a could be used to promote the differentiation of CD14 + PBMCs and inhibit hsa - miR - 148a .


Mechanism of Regulation of Osteoclasts Differentiation by the Third Part of hsa - miR - 148a


Objective : To predict and verify the target gene of hsa - miR - 148a , and to clarify the mechanism of hsa - miR - 148a regulation on the differentiation of CD14 + PBMCs to Osteoclasts .


Methods : The target gene of hsa - miR - 148a was obtained by target gene prediction software of TargetScan and PicTar . The target gene MAFB containing hsa - miR - 148a binding site was cloned into the 3 ' untranslated region of pGL3 vector . The expression vector of wild type reporter vector WT - pGL3 - MAFB - 3 ' was constructed .


Results : ( 1 ) The target gene predicted by TargetScan and PicTar and other target genes predicted MAFB as hsa - miR - 148a . ( 2 ) Compared with the transfected miR - C control group , the luciferase activity of the pre - miR - 148a and WT - pGL3 - MAFB - 3 ' untranslated group was significantly inhibited , whereas the pre - miR - 148a and WT - pcDNA3.1 - MAFB co - transfected group had no effect on the level of MAFB mRNA , and ( 4 ) pre - miR - 148a and WT - pcDNA3.1 - MAFB co - transfected the target gene , which can increase the TRAP mRNA level and reduce the expression level of MAFB protein ;
However , it was suggested that hsa - miR - 148a promoted the differentiation of Osteoclasts mainly by inhibiting the expression of MAFB protein .


Conclusion : ( 1 ) The expression vector of wild - type and mutant MAFB 3 ' utu luciferase reporter gene vector , wild type and mutant MAFB expression vector was constructed . ( 2 ) The target gene was predicted by the target gene prediction software and confirmed by luciferase reporter gene .

【學(xué)位授予單位】：中南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號(hào)】：R329

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1825586