本文選題：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 + 骨橋蛋白�。� 參考：《重慶大學(xué)》2011年碩士論文

【摘要】：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells, MSCs)具有多向分化潛能。在不同培養(yǎng)條件下,MSCs能分化成為多種細(xì)胞。越來越多的證據(jù)表明,MSCs具有廣闊的臨床應(yīng)用前景。除了易于分離獲取、體外增殖潛力巨大和不涉及倫理問題這些優(yōu)勢(shì)外,MSCs還具有趨化特性。趨向受損部位的定向遷移已經(jīng)成為MSCs臨床應(yīng)用研究的關(guān)鍵問題。 骨橋蛋白(osteopontin, OPN)是一種細(xì)胞外基質(zhì)蛋白,在不同的組織細(xì)胞中均有所發(fā)現(xiàn)。當(dāng)機(jī)體各部位受到損傷時(shí),損傷部位的OPN表達(dá)升高。OPN表達(dá)的升高不僅能增加多種細(xì)胞的遷移能力,同時(shí)也能介導(dǎo)細(xì)胞定向遷移。 迄今為止,OPN在MSCs定向遷移過程中的作用還未引起研究者的足夠重視,相關(guān)的研究還鮮見報(bào)道,其分子機(jī)理更不明了。因此,本文試圖揭示外源OPN在大鼠MSCs(rat MSCs, rMSCs)定向遷移過程中的作用及其分子機(jī)理。該研究工作的主要內(nèi)容及結(jié)果如下: 1. rMSCs的原代分離培養(yǎng)及鑒定 利用1.073 g/ml的Percoll密度梯度離心法和rMSCs貼壁特性,體外分離培養(yǎng)rMSCs。結(jié)果表明,原代細(xì)胞14天左右達(dá)到85%融合。傳代后的細(xì)胞貼壁時(shí)間約為半小時(shí)。細(xì)胞24 h內(nèi)即可完全伸展,呈纖維狀。傳代細(xì)胞增殖能力強(qiáng),4~6天達(dá)到80%~90%融合,并形成漩渦樣單層,細(xì)胞形態(tài)趨于一致。流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn),分離得到的細(xì)胞表達(dá)CD44和CD90,但不表達(dá)CD34,符合MSCs表面標(biāo)記抗原的一般規(guī)律。 2. OPN促rMSCs定向遷移 Transwell遷移實(shí)驗(yàn)檢測(cè)OPN是否能夠誘導(dǎo)rMSCs定向遷移。結(jié)果表明,OPN具有促rMSCs定向遷移的能力,并且OPN促rMSCs定向遷移的能力與OPN的濃度呈現(xiàn)一定的劑量相關(guān)性。 3. Integrinβ1介導(dǎo)OPN促rMSCs遷移 為檢測(cè)在遷移過程中,OPN是否能改變細(xì)胞CD44v6或integrinβ1 mRNA的表達(dá),RT-PCR檢測(cè)OPN(1μg/ml)作用rMSCs后,mRNA的表達(dá)變化情況。結(jié)果表明,OPN能使integrinβ1 mRNA的表達(dá)水平增加(1.5倍,p0.01)。但CD44v6 mRNA的表達(dá)情況卻沒有明顯改變。另外,western蛋白印跡表明,OPN作用2.0 h以后,integrinβ1的蛋白表達(dá)開始上升;4.0 h,達(dá)到峰值(1.3倍,p0.05);6.0 h以后,integrinβ1的蛋白表達(dá)開始下調(diào),但依舊高于對(duì)照組。阻斷integrinβ1受體后,OPN促rMSCs定向遷移的能力受到抑制。提示,OPN能夠增加rMSCs中integrinβ1的表達(dá),同時(shí)通過結(jié)合細(xì)胞表面integrinβ1受體,促進(jìn)rMSCs定向遷移。 4.黏著斑激酶(focal adhesion kinase, FAK)/胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal regulated kinase, ERK)信號(hào)通路介導(dǎo)OPN促rMSCs定向遷移Western蛋白印跡檢測(cè)OPN(1μg/ml)作用rMSCs后,磷酸化FAK (phospho-FAK, pFAK)和磷酸化ERK1/2(phospho-ERK1/2, pERK1/2)的表達(dá)變化情況。結(jié)果表明,OPN作用條件下0.5 h, pFAK的表達(dá)量升高(1.3倍,p0.05),FAK信號(hào)通路被激活;pERK1/2在OPN作用0.5 h時(shí),表達(dá)升高(1.7倍,p0.05),1.0 h,達(dá)到峰值(2.8倍,p0.01),2.0 h有所回落(1.3倍,p0.05),4.0 h后與對(duì)照組相比沒差異。抑制劑阻斷OPN激活ERK和FAK信號(hào)通路以后,OPN促rMSCs定向遷移的能力受到抑制。另外,integrinβ1抗體可有效抑制OPN升高pFAK和pERK1/2表達(dá)的作用,阻斷FAK/ERK信號(hào)通路的激活。提示,OPN結(jié)合integrinβ1受體以后,通過激活FAK/ERK信號(hào)通路,促進(jìn)rMSCs定向遷移。 5. OPN改變r(jià)MSCs的力學(xué)性質(zhì) 原子力顯微鏡(atomic force microscope, AFM)檢測(cè)OPN(1μg/ml)作用后,rMSCs楊氏模量的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn),OPN可以顯著降低rMSCs的楊氏模量(p0.05)。另外,阻斷integrinβ1受體,抑或阻斷FAK/ERK信號(hào)分子的激活均能抑制OPN降低細(xì)胞楊氏模量的作用。結(jié)果表明,rMSCs的遷移能力與其細(xì)胞硬度密切相關(guān)。 本文的研究結(jié)果表明,OPN可以通過上調(diào)integrinβ1的表達(dá),激活FAK/ERK信號(hào)通路,降低rMSCs的細(xì)胞硬度,從而促進(jìn)rMSCs定向遷移。結(jié)果提示,機(jī)體受損后,可能通過上調(diào)OPN的表達(dá),誘導(dǎo)rMSCs定向遷移至受損部位,參與受損組織修復(fù)。
[Abstract]:Mesenchymal stem cells (MSCs) has multipotential differentiation potential. Under different culture conditions, MSCs can be differentiated into a variety of cells. More and more evidence shows that MSCs has a broad prospect for clinical application. Besides the advantages of easy separation and acquisition, great proliferation potential in vitro and no ethical problems, MSCs is also found. With the chemotaxis characteristics, directional migration towards damaged parts has become a key issue in the clinical application of MSCs.
Osteopontin (OPN) is an extracellular matrix protein found in various tissue cells. When the parts of the body are damaged, the increase of the expression of OPN in the injured part of the body can not only increase the migration ability of many cells, but also mediate the directed migration of cells.
So far, the role of OPN in the directional migration of MSCs has not aroused enough attention. The related research is rarely reported, and its molecular mechanism is more unknown. Therefore, this paper attempts to reveal the application and molecular mechanism of exogenous OPN in the directional migration of MSCs (rat MSCs, rMSCs) in rats. The fruit is as follows:
Primary culture and identification of 1. rMSCs
Using 1.073 g/ml Percoll density gradient centrifugation and rMSCs adherence, the results of isolation and culture of rMSCs. in vitro showed that the primary cells reached 85% fusion for about 14 days. The cell adhesion time after the passage was about half an hour. The cells could be fully extended and fibrous in the cell 24 h. The cell proliferation ability was strong, and 4~6 days reached 80%~90% fusion and formed the formation and formation of the cells. The cell morphology of the whirlpool like monolayer tends to be consistent. Flow cytometry shows that the isolated cells express CD44 and CD90, but do not express CD34, which conforms to the general rule of the MSCs surface labeled antigen.
2. OPN oriented rMSCs oriented migration
The Transwell migration test detected whether OPN could induce rMSCs oriented migration. The results showed that OPN had the ability to promote rMSCs oriented migration, and the ability of OPN to promote rMSCs oriented migration was related to the dose of OPN.
3. Integrin beta 1 mediated rMSCs migration mediated by OPN
In order to detect whether OPN could change the expression of CD44v6 or integrin beta 1 mRNA in the process of migration, the expression of mRNA was changed by OPN (1 g/ml) by RT-PCR. The results showed that OPN could increase the expression level of integrin beta 1 mRNA, but there was no obvious change in the expression of rMSCs. The blot showed that after the action of OPN 2 h, the protein expression of integrin beta 1 began to rise; 4 h, reaching the peak (1.3 times, P0.05); after 6 h, the protein expression of integrin beta 1 began to be down, but still higher than the control group. After blocking integrin beta 1, the ability of OPN promoting rMSCs to orientate migration was inhibited. It also promotes rMSCs directional migration by binding to the cell surface integrin beta 1 receptor.
4. focal adhesion kinase (FAK) / extracellular signal regulated kinase (extracellular signal)
Regulated kinase, ERK) signaling pathway mediated OPN rMSCs directed migration Western blot to detect OPN (1 u g/ml) acting rMSCs, and the expression changes of phosphorylated FAK (phospho-FAK, pFAK) and phosphorylation. The road was activated; pERK1/2 increased (1.7 times, P0.05), 1 h, reached peak value (2.8 times, P0.01), 2 h fell (1.3 times, P0.05), and 4 h compared with the control group. The inhibitor blocked OPN activation ERK and FAK signal pathways. Inhibition of OPN increases the expression of pFAK and pERK1/2 and blocks the activation of the FAK/ERK signaling pathway. It suggests that OPN promotes rMSCs directed migration by activating the FAK/ERK signaling pathway after the binding of integrin beta 1.
5. OPN changes the mechanical properties of rMSCs
Atomic force microscope (AFM) was used to detect the change of Young's modulus of rMSCs after the action of OPN (1 u g/ml). The results showed that OPN could significantly reduce the young's modulus of rMSCs (P0.05). In addition, blocking integrin beta 1 receptor, or blocking the activation of the FAK/ERK signal molecules could inhibit the reduction of Young's modulus of cells. The mobility of MSCs is closely related to its cell hardness.
The results of this study show that OPN can activate the FAK/ERK signaling pathway by up regulation of the expression of integrin beta 1 and reduce the cell hardness of rMSCs, thus promoting the directional migration of rMSCs. The results suggest that after the organism is damaged, the expression of OPN may be raised to induce the migration of rMSCs to the damaged site and participate in the repair of damaged tissues.

【學(xué)位授予單位】：重慶大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號(hào)】：R329

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本文編號(hào)：1822566