本文選題：PDGF-BB + KLF5��； 參考：《河北醫(yī)科大學》2011年碩士論文

【摘要】：目的:血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cell, VSMC)增殖是高血壓、動脈粥樣硬化和血管再狹窄等血管重塑性疾病的共同細胞病理學基礎(chǔ)。很多生長因子與細胞因子都會引起VSMC的增殖,其中血小板衍生因子BB(PDGF-BB)具有強效的促進VSMC增殖的活性。 Krüpple樣因子5(krüpple-like factor,IKLF/KLF5)是KLF家族中與胚胎發(fā)育、細胞增殖和腫瘤發(fā)生密切相關(guān)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子。我們在前期研究中發(fā)現(xiàn),在血管新生內(nèi)膜的VSMC中,KLF5的表達明顯增加,后者參與反式激活PDGF-A基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)。作為轉(zhuǎn)錄因子,KLF5能夠和許多轉(zhuǎn)錄因子、輔轉(zhuǎn)錄因子發(fā)生相互作用,如RARα、c-jun、CBP, PPAR-δ、HDAC2、p300等相互作用,共同調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄。 hhLIM是LIM家族的成員之一,具有典型的LIM結(jié)構(gòu)域。LIM結(jié)構(gòu)域含兩個鋅指結(jié)構(gòu),提供蛋白結(jié)合界面從而調(diào)節(jié)蛋白與蛋白的相互作用。目前的研究發(fā)現(xiàn),hhLIM作為輔激活因子,可以通過與其他轉(zhuǎn)錄因子相互作用的方式調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄。然而,KLF5與hhLIM是否相互作用以及調(diào)節(jié)細胞增殖的具體分子機制尚不明確。 為了闡明KLF5和hhLIM在PDGF-BB調(diào)節(jié)VSMC增殖中的作用,本文在系統(tǒng)觀察PDGF-BB對VSMC增殖活性影響的基礎(chǔ)上,進一步探討了KLF5和hhLIM在介導PDGF-BB促增殖中的作用和分子機制。旨在為揭示動脈粥樣硬化、高血壓和血管再狹窄等心血管疾病的發(fā)病機制提供新的實驗和理論依據(jù),為心血管疾病的防治提供特異性藥物靶點。 方法:流式細胞光度術(shù)分析細胞周期各時相的分布情況; Western blot分析檢測KLF5、hhLIM和Cyclin E達變化;免疫共沉淀檢查KLF5與hhLIM之間的相互作用;報告基因分析檢測KLF5和hhLIM對CyclinE因表達的影響;免疫組織化學觀察整體水平KLF5、hhLIM和Cyclin E達變化。 結(jié)果: 1 PDGF-BB促進VSMC細胞周期的進程 流式細胞術(shù)分析結(jié)果顯示,與對照組相比,0 ng、5 ng、10 ng、20 ng的PDGF-BB于作用VSMC后,G1期細胞數(shù)量減少,S期細胞數(shù)量增加,表明VSMC在PDGF-BB作用下增殖活性明顯升高。細胞計數(shù)的結(jié)果也顯示,PDGF-BB可以顯著促進VSMC的增殖。上述結(jié)果提示,PDGF-BB可加快VSMC細胞周期進程,促進VSMC增殖。 2 PDGF-BB促進hhLIM的表達 用不同濃度的PDGF-BB刺激細胞24 h后,提取細胞總蛋白進行Western blot分析。Western blot結(jié)果顯示,hhLIM的表達量呈劑量依賴性的增加,而KLF5的表達量沒有明顯的變化。提示,PDGF-BB能誘導hhLIM表達,不影響KLF5表達。 3 PDGF-BB促進KLF5與hhLIM的相互作用 提取被PDGF-BB刺激前后的VSMC總蛋白,進行免疫共沉淀。結(jié)果顯示,在PDGF-BB刺激前后的VSMC中,KLF5和hhLIM均可被共沉淀,提示KLF5與hhLIM之間存在相互作用。PDGF-BB刺激后,免疫沉淀物中的KLF5和hhLIM均明顯增多,說明PDGF-BB促進二者之間的相互作用。 4 KLF5與hhLIM協(xié)同促進球囊損傷誘導的血管內(nèi)膜增生 為探討KLF5和hhLIM在血管重塑中所發(fā)揮的作用,我們用腺病毒轉(zhuǎn)染的方法使球囊損傷的大鼠頸總動脈過表達KLF5和hhLIM。HE染色結(jié)果,球囊損傷14天后,模型組和hhLIM過表達組內(nèi)膜呈彌散性增厚,管腔縮小,內(nèi)膜/中膜(I/M)比值分別為(3.33±0.26)和(3±0.26),兩組之間無明顯差異。而KLF5組(I/M比值4.12±0.23)與共轉(zhuǎn)染KLF5與hhLIM組(I/M比值6.40±0.23)顯著大于模型組和hhLIM過表達組(P0.05),提示hhLIM與KLF5協(xié)同作用促進VSMC增殖。免疫組化結(jié)果顯示,正常血管內(nèi)膜僅有少量PCNA表達。球囊損傷14天時,PCNA陽性染色的細胞及單細胞染色強度均較正常組顯著增高。KLF5組(56±3.6%)尤其是共轉(zhuǎn)染KLF5和hhLIM組(70±2.3%)PCNA陽性染色細胞數(shù)量顯著高于model組(26±3.7%)和hhLIM組(33±1.7%)。上述結(jié)果提示,hhLIM協(xié)同KLF5促進球囊損傷誘導的血管內(nèi)膜增生。 5 KLF5和hhLIM協(xié)同促進血管平滑肌細胞增殖和細胞周期的進程 細胞計數(shù)分析結(jié)果顯示,過表達KLF5血管平滑肌的細胞數(shù)明顯高于過表達hhLIM和pAd組,說明KLF5可以促進VSMC增殖。同時過表達KLF5和hhLIM細胞數(shù)(17±3×104)顯著多于KLF5過表達組(14±2×104),說明hhLIM加速了KLF5促進細胞的增殖的能力。流式細胞術(shù)檢測細胞周期分布結(jié)果顯示,與KLF5過表達組相比,KLF5和hhLIM聯(lián)合過表達組于作用VSMC 24 h后,G1期細胞數(shù)量減少,S期細胞數(shù)量增加,表明VSMC在KLF5和hhLIM聯(lián)合作用下增殖活性明顯升高。進一步在細胞水平上證明hhLIM與KLF5協(xié)同作用促進細胞周期的進程。 6 KLF5和hhLIM協(xié)同促進Cyclin E的表達 為進一步探討KLF5和hhLIM促進細胞增殖的分子機制,我們檢測了一系列細胞周期相關(guān)蛋白的表達水平,Western blot結(jié)果顯示,過表達KLF5后CDK2,CyclinD,CyclinE的表達水平都顯著升高,hhLIM過表達對上述基因表達影響不大,但是,同時過表達KLF5和hhLIM可以顯著激活CyclinE的表達。上述結(jié)果表明,KLF5和hhLIM可能是通過協(xié)同促進CyclinE的表達而促進細胞的增殖。與模型組和KLF5過表達組相比,同時過表達KLF5和hhLIM組的動物模型血管組織中,CyclinE的表達顯著增加。以上結(jié)果分別從細胞水平及整體水平證實,hhLIM可以與KLF5協(xié)同作用促進Cyclin E表達。 7 hhLIM通過KLF5協(xié)同激活CyclinE啟動子 為探討KLF5與hhLIM協(xié)同促進CyclinE表達的分子機制,分別將CyclinE啟動子指導的報告基因質(zhì)粒(Cyclin E-luc)與KLF5和/或hhLIM表達質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染CHO細胞,通過雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)定量分析啟動子的活性。結(jié)果顯示,CHO細胞共轉(zhuǎn)染KLF5和hhLIM后,啟動子所激活的熒光素酶活性與KLF5轉(zhuǎn)染組相比顯著升高。提示,KLF5和hhLIM協(xié)同激活CyclinE基因的啟動子。CylinE啟動子上有兩個特異的KLF5的結(jié)合位點(TCE),為進一步探明二者相互作用的分子機制,我們特異性敲低KLF5和/或hhLIM并給予PDGF-BB刺激,Oligo pull-down結(jié)果顯示,特異性敲低KLF5,KLF5與TCE元件的結(jié)合明顯下降;特異性的敲除hhLIM后,KLF5和CyclinE啟動子區(qū)兩個TCE的結(jié)合都顯著降低,尤其是第一個結(jié)合位點(TCE1)。上述結(jié)果表明:hhLIM可能是通過促進KLF5與CyclinE啟動子區(qū)的第一個TCE元件而協(xié)同激活CyclinE啟動子。 8 hhLIM通過KLF5協(xié)同激活CyclinE表達促進細胞增殖Western Blot結(jié)果顯示,不管有無PDGF-BB刺激,特異性敲低KLF5后CyclinE的表達水平顯著降低。而特異性敲低hhLIM后CyclinE的表達變化不明顯。說明,hhLIM促進Cyclin E的作用是通過KLF5來實現(xiàn)的。整體動物實驗也證明,與模型組(3.33±0.26)相比,特異性敲低KLF5組(0.5±0.5)的大鼠血管內(nèi)膜/中膜比值明顯降低,PCNA陽性染色細胞數(shù)也明顯降低(P0.05)。特異性敲低hhLIM組(5.0±1.7)與模型組相比,無明顯的抑制增殖作用,反而有輕微促增殖作用。Western blot結(jié)果進一步表明,特異性敲低KLF5的大鼠血管CyclinE的表達水平較其他組明顯降低。上述結(jié)果在整體水平及細胞水平證實,hhLIM通過KLF5協(xié)同激活CyclinE表達促進細胞增殖。 結(jié)論: 1 PDGF-BB促進VSMC細胞周期的進程 2 PDGF-BB促進hhLIM的表達和KLF5與hhLIM的相互作用 3 KLF5與hhLIM協(xié)同促進細胞增殖 4 KLF5和hhLIM通過協(xié)同促進Cyclin E的表達促進細胞增殖 5 hhLIM通過KLF5協(xié)同激活CyclinE表達而促進細胞增殖
[Abstract]:Objective : To investigate the proliferation of vascular smooth muscle cell ( SMC ) in hypertension , atherosclerosis and restenosis of vascular restenosis . Many growth factors and cytokines may induce the proliferation of vascular smooth muscle cells . The platelet - derived factor BB ( PDGF - BB ) has a strong effect on the proliferation of vascular smooth muscle cells .


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本文編號：1822085