本文選題：異體復(fù)合組織移植 + 細(xì)胞毒性T細(xì)胞抗原4免疫球蛋白�。� 參考：《第四軍醫(yī)大學(xué)》2011年博士論文

【摘要】：異體復(fù)合組織移植(CTA)對一些顏面部缺損患者是唯一有效的修復(fù)方式。然而,移植術(shù)后長期大量應(yīng)用免疫抑制劑引起的毒副作用是阻礙其進一步廣泛應(yīng)用的主要障礙。因此,尋找能夠有效降低免疫抑制劑用量的方案就成為亟待解決的問題。CTLA4是T細(xì)胞表面的共刺激分子之一,許多實驗證實,由CTLA4分子胞外段和IgGFc段組成的融合蛋白CTLA4Ig能夠有效抑制異體移植后排斥反應(yīng)。本課題將攜帶CTLA4Ig基因的腺病毒通過體外灌注的方法轉(zhuǎn)染至移植物,檢驗這一方案對抑制免疫排斥反應(yīng)的有效性并對其作用機制進行研究。 目的:驗證不同缺血時間對皮瓣組織異體移植后排斥反應(yīng)的影響,選擇最佳的灌注時間。通過體外灌注的方法向復(fù)合組織灌注腺病毒介導(dǎo)的CTLA4Ig基因(AdCTLA4Ig),觀測CTLA4Ig局部表達情況以及對異體復(fù)合組織移植后排斥反應(yīng)的調(diào)節(jié)作用,并對局部表達的CTLA4Ig發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用的機制進行探索。 方法:1.近交系Brown Norway(BN)大鼠下腹部皮瓣移植至Lewis大鼠作為異體復(fù)合組織移植模型。切取皮瓣后,在室溫下分別放置0h、1h、2h、3h后再移植至受體。室溫放置的時間加上顯微縫合耗時的1小時,各組缺血時間分別為1h、2h、3h、4h,記為Isc-1、Isc-2、Isc-3、Isc-4組。觀測不同缺血時間后異體皮瓣的存活情況。術(shù)后取皮瓣組織,制成病理切片,分別進行HE染色和CXCR3免疫組化染色。檢測排斥反應(yīng)的程度和CXCR3陽性細(xì)胞的浸潤情況。 2.近交系BN大鼠下腹部皮瓣移植至Lewis大鼠作為異體復(fù)合組織移植模型。實驗分為5組,分別為:移植后不進行處理作為對照組;對照病毒AdEGFP灌注組;AdCTLA4Ig灌注組;雷帕霉素治療組;AdCTLA4Ig灌注+雷帕霉素聯(lián)合治療組。通過免疫組化、RT-PCR檢測各組移植物內(nèi)及受體肝、肺等器官CTLA4Ig及其基因的表達情況;ELISA法檢測受體血清中CTLA4Ig蛋白的含量;觀測各組異體皮瓣存活情況、病理表現(xiàn);Real-time PCR檢測移植物內(nèi)IFN-γ、IL-4等mRNA的表達變化情況;檢測受體淋巴細(xì)胞對供體和第三方大鼠淋巴細(xì)胞的混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)。 3.取AdEGFP和AdCTLA4Ig灌注組受體次級淋巴器官,制成淋巴細(xì)胞單細(xì)胞懸液,進行CD4~+CD25~+Foxp3~+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞染色,流式細(xì)胞術(shù)檢測調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的比例,比較調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在兩組之間的差異。分別取AdEGFP和AdCTLA4Ig灌注皮瓣,Real-time PCR檢測皮瓣內(nèi)吲哚胺-2,3雙加氧酶(IDO)mRNA及皮瓣內(nèi)Foxp3 mRNA的含量,比較兩組之間的差異。 結(jié)果:1. Isc-1、Isc-2、Isc-3、Isc-4各組移植皮瓣的存活時間分別為:9.0±1.2天、8.6±1.1天、8.8±1.3天、7.0±0.8天。Isc-4組同其他各組相比存活時間顯著縮短。術(shù)后6天,Isc-4組皮瓣淋巴細(xì)胞浸潤程度嚴(yán)重,表皮脫落,比其他各組排斥反應(yīng)征象更嚴(yán)重。Isc-4組表達趨化因子受體CXCR3的浸潤細(xì)胞比例顯著高于其他各組。 2.免疫組化結(jié)果顯示,術(shù)后30天灌注皮瓣中內(nèi)皮細(xì)胞,血管周圍組織內(nèi)有CTLA4Ig蛋白的表達,而受體肝臟組織內(nèi)無目的蛋白表達。RT-PCR,結(jié)果顯示AdCTLA4Ig體外灌注組皮瓣在術(shù)后7、15天CTLA4Ig mRNA表達陽性,而在對照皮膚、肝、肺內(nèi)的表達不明顯,聯(lián)合治療組術(shù)后45天亦未見目的基因表達。Elisa法檢測受體血清中CTLA4Ig的量,目的基因轉(zhuǎn)染組血清中CTLA4Ig的值在25ng/ml之內(nèi)。 存活數(shù)據(jù)經(jīng)分析表明,局部灌注AdCTAL4Ig,顯著延長移植皮瓣的存活時間。聯(lián)合短程、小劑量免疫抑制劑雷帕霉素后,皮瓣存活時間大大延長,最多超過60天。相比于單純藥物組,存活時間有顯著差異。術(shù)后7天取移植皮瓣組織,進行PCR檢測,發(fā)現(xiàn)目的基因灌注組免疫排斥反應(yīng)的相關(guān)分子IFNγ, IL-4的mRNA表達顯著降低,顯示移植物局部免疫反應(yīng)受到抑制。術(shù)后7天,取實驗組或?qū)φ战M受體脾細(xì)胞進行混合淋巴細(xì)胞反應(yīng),結(jié)果顯示實驗組(細(xì)胞刺激率)SI值顯著低于對照組,而用第三方SD鼠脾細(xì)胞刺激時,兩者無統(tǒng)計學(xué)差異。 3.流式細(xì)胞術(shù)檢測顯示,AdEGFP灌注組和AdCTLA4Ig灌注組受體淋巴細(xì)胞中調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的含量未見變化。而AdCTLA4Ig灌注皮瓣中IDO的mRNA表達顯著升高。 結(jié)論:異體皮瓣常溫下缺血時間超過3小時,加重異體排斥反應(yīng)。所以,皮瓣灌注1小時,孵育1小時是體外灌注的合適方案。應(yīng)用這種方案體外灌注腺病毒介導(dǎo)的CTLA4Ig基因,可獲得移植物局部特異性高表達,且有效抑制異體排斥反應(yīng)。體外灌注AdCTLA4Ig基因同短程、小劑量雷帕霉素有協(xié)同效應(yīng)。體外灌注AdCTLA4Ig發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用的機制同調(diào)高局部IDO的量有關(guān),而與受體調(diào)節(jié)性T細(xì)胞無關(guān)。
[Abstract]:Allogeneic complex tissue transplantation ( CTA ) is the only effective way to repair some facial defects . However , it is an urgent problem to find a solution that can effectively reduce the dosage of immunosuppressive agents .

Objective : To verify the effect of different ischemic time on rejection after allotransplantation of skin flap , and to select the best perfusion time . By means of in vitro perfusion method , we observed the local expression of adenovirus - mediated 4Ig gene and the regulation of rejection after allotransplantation , and explored the mechanism of immunoregulatory action on the local expression .

Methods : 1 . The subabdominal skin flap of the inbred line Brown Norway ( BN ) was transplanted to Lewis rats as an allograft model . After the flap was cut , the rats were placed at room temperature for 0h , 1h , 2h , 3h and then transplanted to the receptor . The time after the operation of the skin flap was 1h , 2h , 3h , 4h , respectively .

2 . The subabdominal skin flap of inbred BN rats was transplanted to Lewis rats as a model for allotransplantation . The experiment was divided into five groups : control group , control virus AdEGFP perfusion group , Adon4Ig perfusion group , rapamycin treatment group , Adon4Ig perfusion + rapamycin combination therapy group .

3 . The secondary lymphoid organs of AdEGFP and Ad4Ig perfusion group were used to make lymphocyte single cell suspension . CD4 ~ + CD25 ~ + Foxp3 ~ + regulatory T cells were stained . Flow cytometry was used to detect the proportion of regulatory T cells and to compare the difference between the two groups . AdEGFP and Ad4Ig perfusion flaps were respectively taken . Real - time PCR was used to detect the contents of indoleamine - 2,3 - dioxygenase ( IDO ) mRNA and Foxp3 mRNA in the skin flap , and the difference between the two groups was compared .

Results : 1 . Isc - 1 , Isc - 2 , Isc - 3 , Isc - 4 showed that survival time was 9.0 鹵 1.2 days , 8.6 鹵 1.1 days , 8.8 鹵 1.3 days , 7.0 鹵 0.8 days . Isc - 4 group was more serious than other groups .

2 . Immunohistochemical results showed that endothelial cells and perivascular tissues were expressed in 30 - day post - operative skin flap , but the expression of non - interest protein was not found in the tissues of the receptor . The results showed that the expression of IL - 4 Ig mRNA was not obvious in the control skin , liver and lung , but the expression of the target gene was not seen in the control skin , liver and lung .

Survival data showed that AdCTAL4Ig was infused locally . The survival time of the flap was significantly prolonged . The survival time of the flap was significantly prolonged after the combined short - range and small - dose immune inhibitor rapamycin . The results showed that the expression of IFN - 緯 , IL - 4 mRNA in the experimental group was significantly lower than that in the control group .

3 . Flow cytometry showed that the content of IDO mRNA was not changed in AdEGFP perfusion group and Ad4Ig perfusion group , but the mRNA expression of IDO increased significantly in Ad4 Ig perfusion skin flap .

Conclusion : Allogeneic skin flap is suitable for perfusion in vitro at normal temperature for more than 3 hours . Therefore , it is suitable for perfusion in vitro for 1 hour and 1 hour incubation . In vitro perfusion of adenovirus - mediated 4Ig gene can achieve local high expression of the graft , and can effectively inhibit allograft rejection . In vitro , it is synergistic to the short - range and small - dose rapamycin . In vitro , the mechanism of immunoregulation is related to the amount of high local IDO , but not related to the receptor - regulatory T cell .

【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號】：R392

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本文編號：1801638