本文選題：內(nèi)皮祖細(xì)胞 + 自噬�。� 參考：《復(fù)旦大學(xué)》2011年碩士論文

【摘要】：目的研究EPCs (endothelial progenitor cells)在缺血缺氧狀態(tài)下的自噬變化,探討自噬在細(xì)胞存活和增殖中的作用。方法用密度梯度離心法從人臍帶血中分離單形核細(xì)胞,用VEGFR-2、CD34、CD133抗體標(biāo)記后通過(guò)流式細(xì)胞儀(flow cytometry, FCM)分選VEGFR-2+CD34+和VEGFR-2+CD133+細(xì)胞,進(jìn)一步通過(guò)免疫細(xì)胞化學(xué)染色觀察VEGFR-2、CD34、CD133在EPCs上的共表達(dá),將分選出的EPCs在VEGF作用下誘導(dǎo)擴(kuò)增。建立大鼠心肌梗死模型,選擇3個(gè)部位即正常心肌、梗死周邊及梗死區(qū)心肌分別將FG (fibrin glue)承載的EPCs注射入心肌組織中。通過(guò)半薄切片觀察FG承載的EPCs在心肌組織中的分布,透射電鏡觀察不同部位移植的EPCs的自噬變化。為了明確自噬對(duì)細(xì)胞增殖和活性的影響,本研究用3-MA抑制EPCs自噬后,通過(guò)流式細(xì)胞分析細(xì)胞周期,MTT法檢測(cè)細(xì)胞活性的變化；在檢測(cè)缺氧狀態(tài)下細(xì)胞的自噬變化中,該研究在體外模擬缺氧微環(huán)境,將分選后的EPCs分為五組：對(duì)照組、缺氧1組、缺氧2組、缺氧3組和3-MA組,缺氧1、2、3組分別缺氧30min、1h、2h,在3-MA組中,先用濃度為5mmol/L的3-MA預(yù)處理細(xì)胞1h,然后缺氧1h。經(jīng)缺氧處理后,通過(guò)免疫細(xì)胞化學(xué)染色及RT-PCR檢測(cè)各組細(xì)胞自噬基因Beclin-1的表達(dá)變化；結(jié)合LC3免疫細(xì)胞化學(xué)染色和MDC染色檢測(cè)自噬體及陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目變化；用透射電鏡觀察自噬前體、自噬體和自噬溶酶體的形態(tài)特征,通過(guò)VLCDS圖像分析軟件測(cè)量各組細(xì)胞中自噬相關(guān)結(jié)構(gòu)與細(xì)胞斷面面積,對(duì)兩者比值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析及比較；經(jīng)溶酶體示蹤劑lysoSensorTMND-189標(biāo)記溶酶體后檢測(cè)其數(shù)目變化。為了明確自噬對(duì)缺氧狀態(tài)下細(xì)胞存活的作用,本文采用AO/EB染色及流式細(xì)胞分析檢測(cè)自噬對(duì)缺氧狀態(tài)下細(xì)胞凋亡的影響。結(jié)果與移植于正常心肌的EPCs相比,移植到心梗周邊區(qū)心肌中的EPCs數(shù)量變化不明顯并且細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)少量自噬體,但移植到梗死區(qū)的EPCs數(shù)量明顯減少且細(xì)胞中出現(xiàn)大量自噬體,還可觀察到位于梗死區(qū)的EPCs出現(xiàn)壞死變化。在細(xì)胞增殖和活性的檢測(cè)中,觀察到與對(duì)照組相比,3-MA阻斷自噬后,EPCs的增殖指數(shù)下降,細(xì)胞活性降低。隨著缺氧時(shí)間的延長(zhǎng),自噬基因Beclin-1表達(dá)增強(qiáng),含LC3或MDC標(biāo)記的自噬體及陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目增多,自噬體主要分布于核周邊的細(xì)胞質(zhì)中。透射電鏡下觀察到的自噬前體可呈新月形或杯狀的雙層膜結(jié)構(gòu),新月形自噬前體較厚而杯狀自噬前體較薄,自噬體可表現(xiàn)為雙層膜包裹的圓形或橢圓形結(jié)構(gòu),自噬前體或自噬體包繞細(xì)胞質(zhì)樣無(wú)形結(jié)構(gòu)或受損的線粒體,自噬溶酶體為包繞單層膜自噬體的單層膜結(jié)構(gòu)；與對(duì)照組相比,隨著缺氧時(shí)間的延長(zhǎng),自噬結(jié)構(gòu)與細(xì)胞斷面面積之比增大,與缺氧1h組相比,3-MA組細(xì)胞自噬結(jié)構(gòu)與細(xì)胞斷面面積之比明顯減小。缺氧狀態(tài)下,溶酶體數(shù)目增多且體積變大,3-MA組細(xì)胞中溶酶體數(shù)目明顯降低。在自噬與凋亡關(guān)系研究中,檢測(cè)到缺氧1h可引起少量細(xì)胞發(fā)生凋亡,阻斷自噬后缺氧引起的細(xì)胞凋亡數(shù)目顯著增加。結(jié)論自噬與EPCs的增殖和活性維持有關(guān)。缺血缺氧誘導(dǎo)EPCs自噬增強(qiáng),細(xì)胞可通過(guò)自噬降低缺氧引發(fā)的細(xì)胞凋亡。
[Abstract]:Objective To investigate the autophagy changes of EPCs ( EPCs ) in ischemia and hypoxia , and to investigate the role of autophagy in the survival and proliferation of human umbilical cord blood . The expression of VEGFR - 2 , CD34 and CD133 on EPCs was observed by means of density gradient centrifugation . The distribution of VEGFR - 2 , CD34 and CD133 on EPCs was observed by flow cytometry ( FCM ) .
In this study , the expression of Beclin - 1 was detected by immunohistochemical staining and RT - PCR in the 3 - MA group . The expression of Beclin - 1 was detected by immunohistochemical staining and RT - PCR in the 3 - MA group .
The number of autophagy and positive cells were detected by chemical staining and MDC staining of LC3 immune cells .
The morphological characteristics of autophagy , autophagy and autophagy lysosomes were observed by transmission electron microscope . The autophagy - related structures and cell cross - sectional area in each group were measured by VLCDS image analysis software .
In order to clarify the effect of autophagy on the survival of cells under hypoxic conditions , the number of EPCs transplanted into the myocardial infarction area decreased and the number of autophagy cells appeared in the cells .
In the study of autophagy and apoptosis , the number of lysosomes increased and the volume became larger , and the number of lysosomes in 3 - MA group decreased significantly .

【學(xué)位授予單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號(hào)】：R363

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本文編號(hào)：1796265