本文選題：大鼠卵巢顆粒細(xì)胞 + 生殖毒性　； 參考：《湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)》2011年博士論文

【摘要】：傳統(tǒng)生殖發(fā)育毒理學(xué)試驗的優(yōu)點是能夠?qū)⑸持芷诘难芯坎鸱譃椴煌纳飳W(xué)過程,對其進(jìn)行單一或組合研究或延續(xù)的研究,從而對化學(xué)品的靶器官特異性及其機制進(jìn)行鑒定,更好地解釋化學(xué)品的生物學(xué)特性。但其缺點也是非常明顯的,例如耗資巨大、試驗周期過長、所需試驗動物過多等。如果要實施現(xiàn)行完整的生殖毒性研究(包含二代生殖毒性研究),一次大約需要五千多只動物。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展,組合化學(xué)(combinatorial chemistry)、計算機輔助藥物設(shè)計等新技術(shù)的應(yīng)用使新化學(xué)物質(zhì)日益增多,而傳統(tǒng)的生殖發(fā)育毒理學(xué)評價方法面臨新的挑戰(zhàn),加上全世界每年用于實驗的動物數(shù)以千萬計,從而引發(fā)了各國動物保護(hù)組織的強烈抗議。上述因素極大的推進(jìn)了3R理論,即減少(Reduction)、替代(Replacement)和優(yōu)化(Refinement)試驗動物的倡導(dǎo)與實施,并積極促進(jìn)了生物醫(yī)學(xué)研究模式的轉(zhuǎn)變。因此,替代傳統(tǒng)動物實驗的生殖毒性體外評價模型研究已經(jīng)成為毒理學(xué)發(fā)展的重要方向,并已在一系列的試驗中發(fā)揮了舉足輕重的作用,但由于哺乳動物擁有復(fù)雜的生殖周期,采用生殖與發(fā)育毒性替代法研究最后取得成功的案例很少。由于雌性生殖過程的復(fù)雜性遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過雄性,這使得化學(xué)物質(zhì)雌性生殖毒性的預(yù)測與研究比較困難,因此建立一個既能快速篩選、檢測和鑒定具有雌性生殖毒性化合又能研究其作用機制的體外替代模型,對防治化學(xué)物質(zhì)引起的生殖系統(tǒng)損傷具有十分重要的意義。卵巢顆粒細(xì)胞(Granulosa cell GC)是卵泡內(nèi)的最大細(xì)胞群,也是主要的功能細(xì)胞。GC迅速生長及增殖是卵泡發(fā)育的顯著標(biāo)志之一,而成年動物的卵泡閉鎖,特別是在卵泡發(fā)育后期,主要是由GC凋亡引起。此外,GC與卵泡膜細(xì)胞共同完成卵巢激素的合成,維持卵母細(xì)胞生長和成熟的微環(huán)境。由此可見G；C的增殖、凋亡及激素分泌與卵泡發(fā)育、卵母細(xì)胞成熟密切相關(guān)。 本課題根據(jù)雌性動物的生殖生理特點,以體外培養(yǎng)的大鼠卵巢顆粒細(xì)胞為實驗對象,應(yīng)用細(xì)胞技術(shù)對外源性化合物進(jìn)行生殖毒性篩選和安全性評價,探討卵巢顆粒細(xì)胞應(yīng)用于生殖毒性評價的可靠性與可行性,并將其應(yīng)用于T-2毒素生殖毒性機制的研究中。 目的：建立大鼠卵巢顆粒細(xì)胞體外培養(yǎng)體系,探討其用于雌性生殖毒物鑒定和機制研究的可行性。以體外培養(yǎng)的大鼠卵巢顆粒細(xì)胞為研究對象,從線粒體通路和PKA通路探討T-2毒素引起顆粒細(xì)胞損傷的相應(yīng)機制。方法：對未成年的Wistar大鼠卵巢顆粒細(xì)胞進(jìn)行原代培養(yǎng),并應(yīng)用HE染色和免疫細(xì)胞化學(xué)法對所獲取的細(xì)胞進(jìn)行鑒定；在此基礎(chǔ)上,選擇具有卵巢毒性的化合物環(huán)磷酰胺、白消安、氯丙嗪和T-2毒素對GC進(jìn)行染毒試驗,染毒結(jié)束后通過采用MTT法檢測細(xì)胞相對活力、DNA熒光染料Hoechst 33258檢測顆粒細(xì)胞的凋亡率、ELISA法檢測細(xì)胞孕酮(P)和雌二醇(E2)的分泌情況,從而研究上述化合物的細(xì)胞毒性；從中選取具有明顯細(xì)胞毒性的化合物,應(yīng)用DNA-Ladder檢測細(xì)胞凋亡,半定量RT-PCR檢測凋亡調(diào)控基因Bax、Bcl-2和P53 mRNA以及激素分泌相關(guān)調(diào)控基因FSHR、StAR、P450scc和P450arom mRNA的表達(dá),免疫細(xì)胞化學(xué)染色法檢測顆粒細(xì)胞中特異性受體卵泡刺激素受體(FSHR)的表達(dá)。在此基礎(chǔ)上對未成熟Wistar大鼠卵巢顆粒細(xì)胞進(jìn)行原代培養(yǎng),T-2毒素染毒24后進(jìn)行以下實驗,常規(guī)方法檢測細(xì)胞中SOD、CAT和GSH-Px的活力以及MDA的含量；熒光探針H2-DCFDA和Rh 123分別檢測細(xì)胞內(nèi)ROS生成和線粒體膜電位的變化；ELISA法檢測T-2毒素對PKA通路激活劑FSH、CT、Forsklin、8-Br-cAMP、EGF、Anisomycin、22R-HC和pregnenolone誘導(dǎo)的孕酮和cAMP合成的影響；Western blot檢測凋亡相關(guān)蛋白P53、Bax、Bcl-2、caspase-3和caspase-9以及類固醇激素合成的相關(guān)蛋白酶AC、StAR、3β-HSD、P450scc和P450arom的表達(dá)水平；分光光度法檢測caspase-3和caspase-9的活力；結(jié)果：(1)原代培養(yǎng)的大鼠卵巢顆粒細(xì)胞,體外培養(yǎng)24h后,細(xì)胞貼壁生長,胞質(zhì)富含顆粒,經(jīng)鑒定純度超過90%；(2)環(huán)磷酰胺和白消安不能抑制顆粒細(xì)胞體外增值和激素分泌,對細(xì)胞凋亡也沒有明顯的誘導(dǎo)作用；(3)氯丙嗪和T-2毒素則能夠顯著抑制顆粒細(xì)胞體外增值,干擾其激素分泌,并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,呈濃度依賴關(guān)系；(4)隨著氯丙嗪劑量的增高,在高劑量組出現(xiàn)非常典型階梯狀DNA Ladder, RT-PCR檢測顯示氯丙嗪能引起B(yǎng)cl-2、Bax、P53、FSHR mRNA表達(dá)水平和Bax mRNA/Bcl-2 mRNA比值的增高、StAR mRNA表達(dá)水平的降低,與對照組比較,除0.1μM劑量組的Bax、FSHR mRNA表達(dá)水平和Bax mRNA/Bcl-2 mRNA比值無明顯改變外(P0.05),其余各組均有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01)。此外，，氯內(nèi)嗪在一定濃度范圍內(nèi)(0.1μM-1μM)，能夠促進(jìn)P450scc和P450arom mRNA的表達(dá),當(dāng)氯丙嗪濃度達(dá)到10μM時,P450scc和P450arom mRNA的表達(dá)水平雖略有下降,但與1μM的中劑量組比較并無明顯異(P0.05); FSHR免疫細(xì)胞化學(xué)染色是卵巢顆粒細(xì)胞的一種特異性染色,結(jié)果顯示不同濃度的氯丙嗪均能夠促進(jìn)顆粒細(xì)胞FSHR的表達(dá)(P0.05),并呈現(xiàn)一定的劑量-效應(yīng)關(guān)系；(5)隨著T-2毒素劑量的增高,在高劑量組出現(xiàn)非常典型階梯狀DNA Ladder, RT-PCR檢測顯示T-2毒素能引起B(yǎng)cl-2、Bax、P53、Bax mRNA/Bcl-2 mRNA比值的增高,與對照組比較,除0.1μM劑量組外其余各組均有極顯著差異(P0.01),StAR mRNA表達(dá)水平則顯著降低(P0.01),FSHR mRNA的表達(dá)水平基本沒有受到影響(P0.05)；此外,T-2毒素在一定的濃度范圍內(nèi)(0nM-1nM),能夠促進(jìn)P450scc mRNA和P450arom mRNA的表達(dá),然而當(dāng)T-2毒素濃度達(dá)到10 nM和100nM時,P450scc和P450arom mRNA的表達(dá)水平則明顯降低,與lnM劑量組比較差異顯著(P0.05); FSHR免疫細(xì)胞化學(xué)染色顯示不同濃度的T-2毒素均能夠顯著促進(jìn)顆粒細(xì)胞FSHR的表達(dá)(P0.01),并呈現(xiàn)一定的劑量-效應(yīng)關(guān)系；(6)T-2毒素能劑量依賴性地增加顆粒細(xì)胞內(nèi)ROS的生成和MDA含量,降低SOD、CAT和GSH-Px的活性以及線粒體膜電位,促進(jìn)凋亡相關(guān)蛋P53、Bax、Bcl-2和Bax/Bcl-2表達(dá)水平的上升以及caspase-3和caspase-9的活化,caspase-9抑制劑AC-LEHD-CHO和自由基清除劑Irolox均能在一定程度上抑制由T-2毒素誘導(dǎo)的顆粒細(xì)胞凋亡；(7)T-2毒素能劑量依賴性的抑制顆粒細(xì)胞內(nèi)cAMP的合成,除Forsklin外,FSH和CT均不能抵消T-2毒素對cAMP合成的抑制作用。除22R-HC和pregnenolone外,FSH、CT、Forsklin、8-Br-cAMP、EGF、Anisomycin均不能抵消T-2毒素對顆粒細(xì)胞孕酮合成的抑制作用。隨著T-2毒素染毒劑量的升高,AC、StAR和3β-HSD的蛋白表達(dá)水平顯著下降。與對照組相比,低劑量的T-2毒素(0nM-1 nM)能夠促進(jìn)P450scc和P450arom的表達(dá),但隨著染毒劑量的升高(10nM-100nM),其蛋白表達(dá)水平則隨之下降。結(jié)論：本研究用通過建立的大鼠卵顆粒細(xì)胞體外培養(yǎng)體系研究了四種卵巢毒物對顆粒細(xì)胞的細(xì)胞毒性,初步驗證了大鼠卵巢顆粒細(xì)胞體外生殖毒性評價替代模型用于雌性生殖毒物鑒定與機制研究是可行性。T-2毒素則通過氧化應(yīng)激誘發(fā)了卵巢顆粒細(xì)胞凋亡,而ROS介導(dǎo)的線粒體通路在這一凋亡過程中起著非常重要的作用；PKA通路則在T-2毒素抑制卵巢顆粒細(xì)胞甾體激素分泌過程中起著非常重要的作用,其中AC、StAR、和3p-HSD是T-2毒素作用的關(guān)鍵位點。
[Abstract]:浼犵粺鐢熸畺鍙戣偛姣掔悊瀛﹁瘯楠岀殑浼樼偣鏄兘澶熷皢鐢熸畺鍛ㄦ湡鐨勭爺絀舵媶鍒嗕負(fù)涓嶅悓鐨勭敓鐗╁榪囩▼,瀵瑰叾榪涜鍗曚竴鎴栫粍鍚堢爺絀舵垨寤剁畫鐨勭爺絀

本文編號：1779021