本文選題：丙型肝炎病毒 + 包涵體　； 參考：《北京協(xié)和醫(yī)學院》2011年碩士論文

【摘要】：丙型肝炎病毒(Hepatitis C Virus, HCV)感染導致的慢性肝炎疾病,現在已成為全球性的公共衛(wèi)生問題。鑒于目前對于HCV慢性感染尚無特異性治療方法,且副作用較大,因此研制HCV疫苗對于控制HCV流行具有重要意義。HCV的高度異源性是HCV疫苗研究的重要障礙,通過對來自全球的多株HCV序列分析表明,至少存在6種主要基因型和大約100種基因亞型。由于HCV基因序列存在高度變異性、感染力弱,并且缺乏有效的細胞和動物感染模型,因此采用傳統(tǒng)方法研制丙肝疫苗難以達到目的。多表位疫苗,作為通過篩選與組合優(yōu)勢抗原表位(包括T細胞、B細胞表位)的新型疫苗,能夠產生高效的細胞免疫和體液免疫應答進而清除病毒,其優(yōu)勢在于通過選擇最具免疫保護潛力的表位以覆蓋盡量多的病毒亞型和誘導機體全面的抗病毒免疫應答,它能有效地應付病原微生物的變異,克服主要組織相容性復合體(MHC)分子的遺傳限制。 本研究選取多個HCV基因型中的十個保守性表位,構建了重組抗原多肽CB3的表達基因,并將其連接入載體pBV220進行原核表達,經包涵體洗滌、溶解、復性及離子交換柱純化后,獲得純度較高的目的多肽CB3。 在免疫原性評價研究中,以恒河猴作為實驗動物,從體液免疫和細胞免疫兩個方面對CB3的免疫學效果進行了評價。本研究分別使用15μg和30μg劑量的多肽CB3以0、1、6月的免疫程序免疫恒河猴后,采用ELISA方法檢測到免疫動物體內有特異性抗體的產生,ELISPOT檢測到抗原特異性IFN-γ細胞因子。與對照組相比,均有明顯的統(tǒng)計學差異(P0.05),且30μg劑量組的免疫應答強于15μg組。 在保護性抗體評價方面,本研究采用HCV體外細胞培養(yǎng)模型對免疫后動物血清中的中和抗體進行了檢測。首先將體外轉錄得到的HCV JFH-1株基因組RNA轉染Huh-7細胞,免疫熒光、Western實驗證明有HCV病毒蛋白表達,實時熒光定量PCR證明有HCV病毒基因組的復制。在蛋白水平和RNA水平上證實了HCV病毒的產生后,進行體外中和實驗。結果初步證明CB3能誘發(fā)機體產生一定的保護性中和抗體,在免疫血清稀釋度1：2～1：4時,能夠中和HCV JFH-1株感染Huh-7細胞。
[Abstract]:Chronic hepatitis caused by hepatitis C virus (HCV) infection has become a global public health problem. In view of the fact that there is no specific treatment for chronic HCV infection and its side effects are large, the development of HCV vaccine is of great significance in controlling the prevalence of HCV. The highly heterogenous HCV vaccine is an important obstacle in the research of HCV vaccine. According to the analysis of HCV sequences from all over the world, there are at least 6 major genotypes and about 100 gene subtypes. Because of the high variability of HCV gene sequence, weak infectivity, and the lack of effective models of infection in cells and animals, it is difficult to develop hepatitis C vaccine by traditional methods. Multiepitope vaccines, as a novel vaccine for screening and combining dominant antigen epitopes (including T cell B cell epitopes), can produce highly efficient cellular and humoral immune responses to remove viruses. It has the advantage that by selecting the epitopes with the most potential for immune protection to cover as many virus subtypes as possible and to induce a comprehensive antiviral immune response, it can effectively cope with the variation of pathogenic microorganisms. To overcome the genetic limitation of the major histocompatibility complex (MHC). In this study, ten conserved epitopes of multiple HCV genotypes were selected to construct the expression genes of recombinant antigenic polypeptide CB3, and then ligated into vector pBV220 for prokaryotic expression. After purification by inclusion body washing, dissolution, renaturation and ion exchange column, A high purity target peptide CB3 was obtained. In the study of immunogenicity evaluation, rhesus monkey was used as experimental animal to evaluate the immunological effect of CB3 from humoral immunity and cellular immunity. In this study, rhesus monkeys were immunized with 15 渭 g and 30 渭 g of polypeptide CB3 at a dose of 15 渭 g and 30 渭 g, respectively. After immunizing rhesus monkeys by six months, the production of specific antibodies in immunized animals was detected by ELISA method and antigen-specific IFN- 緯 cytokines were detected by Elispot. Compared with the control group, there was significant statistical difference between the two groups, and the immune response of the 30 渭 g group was stronger than that of the 15 渭 g group. In the aspect of protective antibody evaluation, the neutralizing antibody in animal serum after immunization was detected by HCV cell culture model in vitro. Firstly, the genomic RNA of HCV JFH-1 strain was transfected into Huh-7 cells in vitro. The expression of HCV virus protein was confirmed by immunofluorescence assay, and the replication of HCV virus genome was confirmed by real-time fluorescence quantitative PCR. The production of HCV virus was confirmed at the protein level and RNA level, and neutralized in vitro. Results it was preliminarily demonstrated that CB3 could induce the production of protective neutralizing antibody, and when the dilution of immune serum was 1: 2 / 1: 4, it could neutralize the HCV JFH-1 strain and infect Huh-7 cells.
【學位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2011
【分類號】：R392

【共引文獻】

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本文編號：1778702