本文選題：RNA干擾 + PC12細(xì)胞　； 參考：《昆明醫(yī)學(xué)院》2011年碩士論文

【摘要】：[目的]研究磷酸吡哆醛激酶(pyridoxal kinase, PDXK)、電壓依賴性陰離子通道2(VDAC2, voltage-dependent anion channels 2)、鳥苷酸解離抑制因子α(RhoGDP dissociation inhibitor, RhoGDI-α)、原肌球蛋白4(tropomyosin 4, TM4)、β-突軸核蛋白(β-synuclein,β-sncb)在PC12細(xì)胞生長(zhǎng)中的作用。 [方法]化學(xué)合成三條分別針對(duì)PDXK、VDAC2、RhoGDI-α、TM4、β-sncb五個(gè)基因的siRNA序列(Si-r-PDXK_K1、2、3, Si-r-VDAC2_1、2、3, Si-r-RhoGDI-a_1、2、3, Si-r-TM4_1、2、3, Si-r-β-sncb_1、2、3),同時(shí)化學(xué)合成一條隨機(jī)陰性序列對(duì)照siRNA SCR(scramble siRNA);使用陽(yáng)離子脂質(zhì)體Lipofectamine2000TM作為轉(zhuǎn)染試劑,將PDXK、VDAC2、RhoGDI-α、TM4、β-sncb基因的siRNA轉(zhuǎn)染入大鼠腎上腺嗜鉻瘤細(xì)胞(PC12細(xì)胞),RT-PCR技術(shù)篩選出最佳干擾序列；24h時(shí)用免疫細(xì)胞化學(xué)染色觀察細(xì)胞內(nèi)五種蛋白表達(dá)情況、MTT法檢測(cè)五種基因干擾對(duì)PC12細(xì)胞增殖和細(xì)胞形態(tài)及數(shù)量的影響。 [結(jié)果] 1、PDXK基因干擾結(jié)果：Si-r-PDXK_1組與siRNA SCR組相比,PDXK mRNA表達(dá)明顯被抑制,胞漿內(nèi)PDXK蛋白表達(dá)明顯下降,而Si-r-PDXK_2組和Si-r-PDXK_3組與siRNA SCR組相比PDXK mRNA表達(dá)未被抑制(P0.05),說(shuō)明Si-r-PDXK_1能有效干擾靶基因PDXK表達(dá)水平。MTT檢測(cè)及細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果顯示Si-r-PDXK_1組終濃度為80nM、100nM組細(xì)胞活力明顯降低且細(xì)胞數(shù)量明顯減少(P0.05)。 2、VDAC2基因干擾結(jié)果：與siRNA SCR組相比,Si-r-VDAC2_1、2、3各濃度組VDAC2 mRNA均表達(dá)明顯被抑制(P0.05); MTT檢測(cè)結(jié)果顯示Si-r-VDAC2_1終濃度為100nM、Si-r-VDAC2_3終濃度為50nM組別細(xì)胞活力與siRNA SCR組細(xì)胞活力相比均減低(P0.05)；細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果顯示Si-r-VDAC2 3終濃度為50nM與siRNA SCR組細(xì)胞數(shù)比較,Si-r-VDAC2_3終濃度為50nM組別細(xì)胞數(shù)量明顯減少(P0.05)。 3、RhoGDI-α基因干擾結(jié)果：與siRNA SCR組比較,Si-r-RhoGDI-α_1終濃度為50nM、100nM, Si-r-RhoGDI-α_2終濃度為100nM, Si-r-RhoGDI-α_3終濃度為50nM、100nM對(duì)RhoGDI-αmRNA表達(dá)均具有抑制作用(P0.05)；但Si-r-RhoGDI-a_1、2、3干擾對(duì)細(xì)胞活力及細(xì)胞數(shù)量無(wú)明顯影響(P0.05)。 4、TM4基因干擾結(jié)果：與siRNA SCR組比較,Si-r-TM4_2終濃度為80nM及Si-r-TM4_3終濃度為50nM、80nM、100nM對(duì)TM4 mRNA的表達(dá)具有抑制作用(P0.05)；MTT檢測(cè)結(jié)果提示Si-r-TM4_1終濃度為50nM組和Si-r-TM4_3終濃度為80nM及100nM組細(xì)胞活力與siRNA SCR組細(xì)胞活力相比均減低(P0.05)。細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果提示Si-r-TM4_1終濃度為50nM、80nM及Si-r-TM4_3終濃度為50nM、80nM、100nM與siRNA SCR組比較,細(xì)胞數(shù)量明顯減少(P0.05)。 5、β-sncb基因干擾結(jié)果：MTT檢測(cè)結(jié)果提示,Si-r-β-sncb_2終濃度為50nM組別及Si-r-β-sncb_3終濃度為100nM組別細(xì)胞活力與siRNA SCR組細(xì)胞活力相比均減低(P0.05)；細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果提示Si-r-β-sncb_3終濃度為80nM與siRNASCR組比較,數(shù)量明顯減少(P0.05)。 [結(jié)論] 特異性siRNA在相應(yīng)干擾序列和相應(yīng)濃度下,可有效降低PC12細(xì)胞PDXK、VDAC2、RhoGDI-a、TM4、β-sncb基因表達(dá),其中PDXK、VDAC2、TM4、β-sncb表達(dá)降低后可明顯抑制PC12細(xì)胞增殖及生長(zhǎng)。然而盡管RhoGDI-a基因被有效干擾,但對(duì)PC12細(xì)胞生長(zhǎng)沒(méi)有明顯影響。本實(shí)驗(yàn)不僅建立了體外RNA干擾技術(shù),而且利用該技術(shù)發(fā)現(xiàn)四種基因能影響PC12細(xì)胞存活及生長(zhǎng),從而為研究損傷狀態(tài)下這些基因的體內(nèi)功能提供了前期實(shí)驗(yàn)證據(jù)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：昆明醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號(hào)】：R346

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1765756