發(fā)布時(shí)間：2018-04-17 21:09

  本文選題：間充質(zhì)干細(xì)胞 + 骨髓��； 參考：《蘇州大學(xué)》2011年博士論文

【摘要】：第一部分人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)及鑒定 目的從人骨髓中分離培養(yǎng)hMSCs并對其細(xì)胞生物學(xué)特性進(jìn)行觀察。方法無菌條件下在健康志愿者髂棘處穿刺抽取骨髓,運(yùn)用密度梯度離心法分離骨髓單個(gè)核細(xì)胞,培養(yǎng)在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中,再利用貼壁篩選法純化獲得人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,對其進(jìn)行細(xì)胞生長和形態(tài)學(xué)的觀察,流式細(xì)胞儀檢測第3代hMSCs細(xì)胞表面標(biāo)志并分析細(xì)胞周期。結(jié)果所分離培養(yǎng)出的細(xì)胞形態(tài)呈長梭形,漩渦狀生長,純度隨傳代次數(shù)增加而提高,8代以后細(xì)胞擴(kuò)增速度變慢,細(xì)胞形態(tài)也發(fā)生改變。P3代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的表面標(biāo)志CD90、CD105表達(dá)強(qiáng)陽性,而CD34、CD11b陰性。第1、3、5代hMSCs生長曲線呈S形,無顯著性差異,均經(jīng)歷潛伏期、對數(shù)增殖期和停滯期三個(gè)時(shí)期。培養(yǎng)的第3代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中處于G0/G1期的細(xì)胞比例約為77.42%,處于S+G2/M期的細(xì)胞比例為22.58%左右。結(jié)論采用密度梯度離心結(jié)合貼壁篩選培養(yǎng)法可獲得純度較高且增殖活性強(qiáng)的人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,是一種簡單、經(jīng)濟(jì)、有效的分離純化骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的方法。 第二部分硅酸二鈣涂層離子溶液對人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖及凋亡的影響 目的通過硅酸二鈣涂層離子溶液與人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合培養(yǎng),試圖闡明硅酸二鈣涂層離子溶液對人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期及凋亡的影響。方法將等離子噴涂的硅酸二鈣涂層鈦片浸泡在DMEM培養(yǎng)基中,37℃下靜置72小時(shí),電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜儀(ICP)測定培養(yǎng)基中Si、Ca、P離子濃度的變化。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分別培養(yǎng)在四種培養(yǎng)基(OS-DS-、OS-DS+、OS+DS-、OS+DS+)中,MTT法測定細(xì)胞增殖情況,流式細(xì)胞儀檢測hMSCs位于G0/G1、S、G2/M期的細(xì)胞數(shù)及增殖指數(shù)、細(xì)胞凋亡率。結(jié)果與OS-DS-培養(yǎng)基相比,OS-DS+、OS+DS+培養(yǎng)基中Si離子濃度顯著升高(P0.05);OS-DS+、OS+DS-和OS+DS+培養(yǎng)基中Ca離子濃度略有下降,但沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;OS+DS-、OS+DS+培養(yǎng)基中P離子濃度明顯增高。在培養(yǎng)的1~4天,OS-DS+和OS+DS+組細(xì)胞增殖率高于OS-DS-組,并分別在第2、3天時(shí)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;OS+DS-組的細(xì)胞數(shù)始終低于OS-DS-組,在第7天時(shí)有顯著性差異(P0.05)。流式細(xì)胞儀測定結(jié)果顯示,在第4天時(shí),OS-DS+和OS+DS+組處于G0/G1期的細(xì)胞比例明顯低于OS-DS-組,G2/M期細(xì)胞比例明顯高于OS-DS-組(P0.05);OS+DS-組處于S期的細(xì)胞數(shù)在第4天時(shí)比OS-DS-組明顯減少,而OS+DS+和OS-DS+組S期的細(xì)胞比例分別在第4、14天明顯高于OS-DS-組。和OS-DS-組比較,OS+DS-和OS+DS+組細(xì)胞凋亡率在第7、14天顯著增高,而OS-DS+組細(xì)胞凋亡率在第14天明顯高于OS-DS-組(P0.05)。結(jié)論硅酸二鈣涂層離子溶液能促進(jìn)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的早期增殖,其促細(xì)胞增殖的能力可能與培養(yǎng)基中較高的硅離子濃度有關(guān),通過加速骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞周期的轉(zhuǎn)換而達(dá)到的。 第三部分硅酸二鈣涂層離子溶液促進(jìn)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的研究 目的通過檢測骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化過程中特異性基因的表達(dá),探討硅酸二鈣涂層離子溶液對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的影響。方法人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分別培養(yǎng)在四種培養(yǎng)基(OS-DS-、OS-DS+、OS+DS-、OS+DS+)中,采用對硝基苯磷酸鹽法測定細(xì)胞內(nèi)堿性磷酸酶(ALP)活性,茜素紅S染色方法觀察鈣化結(jié)節(jié)的形成,以半定量RT-PCR檢測轉(zhuǎn)錄因子Runx2、I型膠原、骨結(jié)合素及骨鈣素的基因表達(dá)情況。結(jié)果在整個(gè)培養(yǎng)過程中OS+DS-、OS+DS+組ALP活性顯著高于OS-DS-和OS-DS+組;在第7、14和21天時(shí),OS+DS+組細(xì)胞內(nèi)ALP活性明顯高于OS+DS-組;從第7天起,OS-DS+組ALP活性高于OS-DS-組,并于第14天時(shí)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在培養(yǎng)的第14天,OS-DS+、OS+DS-和OS+DS+組鈣沉積的OD值均高于OS-DS-組,有顯著性差異(P0.05);與OS+DS-組相比,OS+DS+組鈣沉積的OD值明顯增高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。培養(yǎng)28天后,OS+DS+組鈣化結(jié)節(jié)的數(shù)量和著色程度均較OS+DS-組明顯增加,其他兩組未見鈣化結(jié)節(jié)形成。在第4、7、14天時(shí),成骨誘導(dǎo)組hMSCs成骨分化相關(guān)標(biāo)志基因的表達(dá)量顯著高于非成骨誘導(dǎo)組;OS-DS+組Runx2與骨結(jié)合素mRNA表達(dá)水平分別在第7、14天明顯高于OS-DS-組;在第14天,OS+DS+組各特異性基因的表達(dá)量均顯著高于OS+DS-組。結(jié)論硅酸二鈣涂層離子溶液自身能夠在一定程度上誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化;和成骨誘導(dǎo)劑協(xié)同,則促進(jìn)鈣沉積及骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化。 第四部分硅酸二鈣涂層離子溶液促進(jìn)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化機(jī)制的研究 目的探討硅酸二鈣涂層離子溶液促進(jìn)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的可能分子機(jī)制。方法骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分別培養(yǎng)在三組培養(yǎng)基(OS+DS-、OS+DS+、OS+DS+/PD)中,以Western blot方法檢測細(xì)胞內(nèi)ERK的磷酸化表達(dá)情況;加入ERK特異性抑制劑PD98059后,分別采用對硝基苯磷酸鹽法、茜素紅S染色方法測定堿性磷酸酶活性與鈣沉積變化。結(jié)果與OS+DS-組相比,在第7、14及21天,OS+DS+組細(xì)胞內(nèi)堿性磷酸酶活性顯著增加(P0.05),其作用可被ERK途徑抑制劑PD98059阻斷(P0.01)。OS+DS+組鈣沉積在第14天時(shí)明顯高于OS+DS-組(P0.05),其作用也可被PD98059抑制,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。hMSCs受到OS+DS+培養(yǎng)基作用后10 min,細(xì)胞中磷酸化的ERK表達(dá)顯著增強(qiáng)(P0.01),并維持在較高水平至60 min,隨后磷酸化的ERK表達(dá)逐漸降低到基線水平。比較三組培養(yǎng)基作用10 min后ERK相對表達(dá)量,發(fā)現(xiàn)PD98059顯著抑制ERK磷酸化的水平,有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.01)。結(jié)論硅酸二鈣涂層離子溶液能夠促進(jìn)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化,ERK信號通路在此過程中發(fā)揮了調(diào)控作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號】：R329

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：1765288