本文選題：呼吸道合胞病毒 + 抗病毒作用　； 參考：《北京中醫(yī)藥大學(xué)》2012年博士論文

【摘要】：呼吸道合胞病毒和腺病毒是兒童呼吸道感染的常見(jiàn)病原,這兩種病毒具有致病力強(qiáng),發(fā)病率高的特點(diǎn),常因院內(nèi)感染引起爆發(fā)流行,目前仍缺乏對(duì)呼吸道合胞病毒和腺病毒治療較好的藥物。國(guó)內(nèi)外有關(guān)于雄黃治療病毒性疾病的臨床報(bào)道,尚無(wú)雄黃抗病毒的實(shí)驗(yàn)研究。本實(shí)驗(yàn)選擇非階段性的單鏈負(fù)股RNA病毒-呼吸道合胞病毒(respiratoy syncytialvirus,RSV)和屬于雙鏈DNA病毒-腺病毒(Adenovirus,ADV)為研究對(duì)象,觀察雄黃納米微�？谷�3型腺病毒(Human Adenovirus-3, HAdV-3)和RSV的作用。同時(shí)由于在HAdV-3感染早期,病毒為了最大限度地增殖與傳播,抑制感染細(xì)胞凋亡,以保證自己能夠在細(xì)胞凋亡前產(chǎn)生足夠數(shù)量的子代病毒以及逃避宿主的免疫監(jiān)視系統(tǒng)。本研究在腺病毒感染早期,通過(guò)觀察雄黃納米微粒對(duì)PI3-K (phosphatidylinositol3-kinase,磷脂酰肌醇3-激酶)/AKT (v-akt murine thymoma viral oncogene homolog)通路的抑制作用,誘導(dǎo)腺病毒感染細(xì)胞凋亡,來(lái)探討雄黃抗病毒的作用機(jī)制,揭示雄黃納米微�？瓜俨《痉肿影悬c(diǎn)。 目的 1通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)建立RSV和HAdV-3感染Hep-2的細(xì)胞模型,觀察雄黃納米微粒對(duì)細(xì)胞病變(Cytopathic effect, CPE)的抑制作用,并采用熒光定量RT-PCR和PCR的方法檢測(cè)雄黃對(duì)RSV和HAdV-3病毒基因表達(dá)的影響,探討雄黃納米微粒抑制RSV和HAdV-3核酸復(fù)制的作用。 2研究雄黃納米微粒在腺病毒感染早期誘導(dǎo)病毒感染細(xì)胞凋亡的機(jī)制。通過(guò)激光共聚焦顯微鏡觀察雄黃納米微粒干預(yù)腺病毒感染早期細(xì)胞凋亡情況。采用western-blot法觀察雄黃納米微粒對(duì)腺病毒感染Hep-2細(xì)胞的AKT、p-AKT、NF-κB p65蛋白表達(dá)的影響,同時(shí)采用RT-PCR法檢測(cè)雄黃納米微粒對(duì)腺病毒感染Hep-2細(xì)胞凋亡蛋白Fas L、Bc1-2、bax及p53mRNA基因表達(dá)的影響,探討雄黃納米微粒抑制PI3-K通路誘導(dǎo)腺病毒感染細(xì)胞凋亡而起到抗病毒的作用。 方法 1雄黃納米微粒對(duì)腺病毒及呼吸道合胞病毒復(fù)制的影響：采用CPE抑制實(shí)驗(yàn),通過(guò)預(yù)防給藥、治療給藥及直接滅活給藥三種方式,在細(xì)胞水平上觀察雄黃納米微粒對(duì)腺病毒和呼吸道合胞病毒感染Hep-2細(xì)胞病變的抑制作用；采用熒光定量PCR和熒光定量RT-PCR的方法觀察雄黃納米微粒對(duì)腺病毒和呼吸道合胞病毒基因表達(dá)的影響,探討雄黃納米微�？笵NA病毒和RNA病毒的作用。 2觀察雄黃納米微粒對(duì)腺病毒感染Hep-2細(xì)胞活性的影響：分別在腺病毒感染Hep-2細(xì)胞的24h、48h、72h和120h時(shí),采用MTT方法觀察不同濃度雄黃納米微粒對(duì)腺病毒感染Hep-2細(xì)胞A值的影響。 3雄黃納米微粒對(duì)腺病毒感染Hep-2細(xì)胞凋亡的影響：采用Annexin V/PI雙染法激光共聚焦顯微鏡觀察雄黃納米微粒大劑量組和小劑量組在腺病毒感染24h時(shí)誘導(dǎo)病毒感染早期細(xì)胞凋亡的情況。 4雄黃納米微粒對(duì)腺病毒感染Hep-2細(xì)胞PI3-K通路的影響：采用western-blot的方法研究雄黃納米微粒大劑量組和小劑量組在腺病毒感染24h時(shí)Hep-2細(xì)胞中AKT、 p-AKT、NF-κB p65蛋白表達(dá)的水平,探討雄黃納米微粒對(duì)PI3-K通路的影響。 5雄黃納米微粒對(duì)腺病毒感染細(xì)胞凋亡調(diào)控蛋白FasL、P53、Bc1-2、Bax基因表達(dá)的影響：采用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR的方法研究雄黃納米微粒大劑量組和小劑量組,在腺病毒感染24h時(shí)細(xì)胞凋亡調(diào)控蛋白FasL、P53、Bc1-2、Bax mRNA的基因表達(dá)。 結(jié)果 1雄黃納米微粒在預(yù)防、治療及直接滅活三種給藥方式下,均可減輕HAdV-3和RSV感染Hep-2細(xì)胞的CPE程度。其中,雄黃納米微�？笻AdV-3的半數(shù)有效濃度(IC50)分別為0.255μg/mL、0.142μg/mL、0.117μg/mL,治療指數(shù)(TI)分別為2.55、4.57和5.55；雄黃納米微粒抑制RSV感染Hep-2細(xì)胞病變的半數(shù)有效濃度(IC50)分別為0.20μg/mL、0.13μg/mL、0.16μ/mL,治療指數(shù)(TI)分別為3.18、4.99和4.11。雄黃納米微粒對(duì)HAdV-3和RSV感染Hep-2細(xì)胞CPE抑制作用均存在著量效關(guān)系。 2熒光定量PCR和RT-PCR檢測(cè)雄黃納米微粒對(duì)HAdV-3和RSV感染Hep-2細(xì)胞病毒復(fù)制量,結(jié)果顯示Hep-2細(xì)胞對(duì)照組無(wú)擴(kuò)增曲線,CT35,HAdV-3和RSV病原體檢測(cè)均為陰性；雄黃納米微粒(加腺病毒)組、利巴韋林(加腺病毒)組和腺病毒模型組擴(kuò)增曲線的CT值分別為29.30±0.08、33.05±1.29、26.01±0.25,腺病毒病原體檢測(cè)為陽(yáng)性。與腺病毒組(66699932±23.85)相比,雄黃納米微粒(加腺病毒)組的復(fù)制量(912435.44±16.57)和利巴韋林(加腺病毒)組的復(fù)制量(459124.84±12.82)均降低,具有顯著性差異(P0.05)。雄黃納米微粒(加呼吸道合胞病毒)組、利巴韋林組(加呼吸道合胞病毒)和呼吸道合胞病毒組擴(kuò)增曲線的CT值分別為25.58±0.19、27.42±5.74、17.59±0.1,呼吸道合胞病毒病原體檢測(cè)為陽(yáng)性。與呼吸道合胞病毒組(70952000±46.14)相比,雄黃納米微粒(加呼吸道合胞病毒)組的復(fù)制量(1123500±20.25)和利巴韋林(加呼吸道合胞病毒)組的復(fù)制量(426593.78±49.02)均降低,差異顯著(PO.05)。 3通過(guò)MTT法和激光共聚焦顯微鏡觀察雄黃納米微粒誘導(dǎo)腺病毒感染Hep-2細(xì)胞凋亡,結(jié)果顯示雄黃納米微粒0.367μg/mL、0.184μg/mL、0.092μg/mL、0.046μg/mL劑量組在HAdV-3感染24h時(shí)可誘導(dǎo)HAdV-3感染Hep-2細(xì)胞凋亡,同時(shí)經(jīng)激光共聚焦顯微鏡觀察顯示雄黃大劑量組的細(xì)胞凋亡較小劑量組更明顯；當(dāng)雄黃納米微粒作用到48h時(shí)可減輕HAdV-3感染細(xì)胞病變,細(xì)胞存活率明顯多于腺病毒對(duì)照組,其對(duì)腺病毒CPE的抑制作用可以持續(xù)至120h。 4雄黃納米微粒可通過(guò)作用于PI3-K介導(dǎo)的信號(hào)通路,降低磷酸化AKT和NF-κB p65蛋白表達(dá)的水平,增加促凋亡蛋白P53、FasL、Bax mRNA表達(dá),降低抑凋亡蛋白Bcl-2mRNA表達(dá),說(shuō)明雄黃納米微�？赡茉谙俨《靖腥驹缙谡T導(dǎo)感染細(xì)胞凋亡,發(fā)揮抗病毒的作用。 結(jié)論 1本研究證實(shí)了雄黃納米微粒具有抗腺病毒和呼吸道合胞病毒的作用,填補(bǔ)了雄黃抗病毒實(shí)驗(yàn)研究的空白； 2雄黃納米微�？稍谙俨《靖腥驹缙谕ㄟ^(guò)抑制PI3-K通路,降低AKT的磷酸化,促染早期細(xì)胞凋亡,從而起到抑制腺病毒復(fù)制的作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：北京中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類(lèi)號(hào)】：R373

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 姜瑞芹;中西醫(yī)結(jié)合治療小兒腺病毒肺炎85例[J];安徽中醫(yī)臨床雜志;2003年02期

2 王霞,譚勇,何祥光;辨證分型論治小兒腺病毒肺炎43例報(bào)告[J];中醫(yī)藥臨床雜志;2004年05期

3 刁慧敏;江楊帆;周秀紅;蔡標(biāo);吳亦倫;;重組人干擾素α-2b體外抗呼吸道合胞病毒作用的實(shí)驗(yàn)研究[J];安徽醫(yī)學(xué);2009年05期

4 江楊帆;刁慧敏;周秀紅;何素冰;吳納新;盛曉蓉;;射岑含片體外抗腺病毒3型作用的實(shí)驗(yàn)研究[J];安徽醫(yī)學(xué);2010年09期

5 張晨,黃世林,向陽(yáng);雄黃對(duì)Raji細(xì)胞凋亡的影響[J];安徽中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào);2003年02期

6 張淑芹,曹悅?cè)?孫非,劉志屹,劉建偉;蟾苷提取物抗腺病毒的實(shí)驗(yàn)研究[J];長(zhǎng)春中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào);2003年04期

7 陳思宇,劉陜西,李信民;硫化砷誘導(dǎo)K562細(xì)胞凋亡中Bcl-2和Bax的表達(dá)[J];第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào);2002年09期

8 李靜,劉陜西,張梅,曹云新;雄黃對(duì)K562細(xì)胞端粒酶活性和凋亡的作用[J];第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào);2003年17期

9 毛曉健;錢(qián)新華;;2005～2007年廣州地區(qū)住院肺炎患兒腺病毒感染分析[J];南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào);2009年02期

10 胡春芳;劉建興;林賽鷹;彭能泉;;雄黃治療皮膚病致人死亡1例[J];法醫(yī)學(xué)雜志;2006年03期

，

本文編號(hào)：1763882