發(fā)布時(shí)間：2018-04-16 03:20

  本文選題：酵母雙雜交 + 雙分子熒光互補(bǔ)��； 參考：《山西師范大學(xué)》2012年碩士論文

【摘要】：根據(jù)構(gòu)建的酵母雙雜交模型來篩選雙黃連口服液中能抑制甲型流感非結(jié)構(gòu)蛋白NS1和人切割與多聚腺苷酸化特異性因子CPSF30結(jié)合的抑制成分。首先將雙黃連口服液原藥設(shè)置幾個(gè)濃度（v/v），分別為0.15、0.2、0.25、0.3、0.35，將其加入平板中后接上酵母雙雜交模型菌，結(jié)果得出雙黃連口服液對(duì)模型菌的抑制濃度為0.3。采用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇將雙黃連口服液分成四段—石油醚相、乙酸乙酯相、正丁醇相和水相，根據(jù)雙黃連原藥的抑制濃度對(duì)其進(jìn)行活性篩選，最終發(fā)現(xiàn)乙酸乙酯相有活性，表明乙酸乙酯相中有抑制NS1與CPSF30結(jié)合的活性物質(zhì)。通過硅膠層析法將乙酸乙酯相分離，共得到20個(gè)組分�；钚院Y選后確定二氯甲烷與甲醇比為98:2時(shí)洗脫的組分有活性。 基于黃色熒光蛋白（yellow fluorescence protein，YFP）的BiFC系統(tǒng)是一種較成熟的研究蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)間相互作用的方法。這種方法主要是將YFP從特定位點(diǎn)切開后形成兩個(gè)沒有熒光的C-片段和N-片段，通過一定的方法將這兩個(gè)片段分別與甲型流感非結(jié)構(gòu)蛋白NS1和人CPSF30蛋白結(jié)合形成融合蛋白。由于NS1和CPSF30兩個(gè)蛋白間有相互作用，在其牽引下融合的兩個(gè)熒光蛋白片段就會(huì)相互靠近重新組成一完整的熒光蛋白，從而在顯微鏡下觀察顯示黃綠色熒光。本實(shí)驗(yàn)通過構(gòu)建4個(gè)中間載體來完成黃色熒光蛋白的兩個(gè)片段與NS1和CPSF30的融合。最終獲得包含兩個(gè)融合蛋白的兩個(gè)載體pGAL10CYCNS1-VN和pGAL10CYCCPSF-VC，將其通過LiAc方法同時(shí)轉(zhuǎn)入釀酒酵母菌W303B中，獲得重組釀酒酵母W303B[pGAL10CYCNS1-VN+pGAL10CYCCPSF-VC]。通過PCR擴(kuò)增條帶進(jìn)一步證實(shí)了模型的準(zhǔn)確性。經(jīng)過制作玻片在熒光顯微鏡下對(duì)模型菌進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)酵母菌在藍(lán)光激發(fā)下呈現(xiàn)黃綠色，證實(shí)了蛋白NS1和人CPSF30蛋白已經(jīng)發(fā)生了相互作用；用分別加有葡萄糖和半乳糖的YPD培養(yǎng)基培養(yǎng)模型菌，在熒光顯微鏡下觀察模型菌，藍(lán)光激發(fā)下加有半乳糖的YPD培養(yǎng)基培養(yǎng)的模型菌呈現(xiàn)黃綠色熒光，而加有葡萄糖培養(yǎng)的模型菌無熒光出現(xiàn)，這說明熒光蛋白啟動(dòng)子是受葡萄糖抑制的。這為篩選到抑制NS1和CPSF30結(jié)合的抑制劑奠定了一定的基礎(chǔ)。 此外，為了將來構(gòu)建雙色或多色熒光互補(bǔ)模型奠定理論基礎(chǔ)，論文對(duì)紅色熒光蛋白在酵母中的表達(dá)特性作了初步的研究。根據(jù)已發(fā)表基因序列設(shè)計(jì)引物，采用連續(xù)重疊PCR方法快速克隆獲得全長(zhǎng)Dsred基因，將其與pMD-18T載體連接后進(jìn)行測(cè)序鑒定。通過In-fusion方法將鑒定正確的pMD-Dsred重組載體與釀酒酵母表達(dá)載體pYeDP60進(jìn)行連接，測(cè)序后利用LiAc方法將鑒定正確的pYeDP60-Dsred重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化至釀酒酵母菌W303-1B中，PCR擴(kuò)增篩選陽(yáng)性克隆，獲得的W303B[pYeDP60-Dsred]工程菌經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)后進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析和綠光激發(fā)熒光成像檢測(cè)。PCR擴(kuò)增篩選和SDS-PAGE分析顯示，pYeDP60-Dsred重組表達(dá)載體已成功導(dǎo)入釀酒酵母菌中，誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物相對(duì)分子質(zhì)量與預(yù)期相符，且誘導(dǎo)后工程菌可在綠光激發(fā)下發(fā)出紅色熒光。 金絲桃素合酶能催化大黃素生成金絲桃素，根據(jù)已經(jīng)發(fā)表的金絲桃素合成酶基因序列，設(shè)計(jì)了6對(duì)引物，通過連續(xù)重疊PCR快速克隆得到了金絲桃素合成酶基因Hyp-1。構(gòu)建含Hyp-1基因的原核表達(dá)載體pET32ahyp，將該載體導(dǎo)入大腸桿菌進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。SDS-PAGE結(jié)果顯示樣品在36kDa處有條帶，符合理論值的條帶表明，而對(duì)照在相應(yīng)位置沒有條帶出現(xiàn)，這說明Hyp-1基因在大腸桿菌中獲得表達(dá)；通過Western blot檢測(cè)，結(jié)果表明，與對(duì)照相比，，E.coli[pET32ahyp]經(jīng)免疫印跡后，在相應(yīng)的位置上出現(xiàn)了一條相應(yīng)的雜交帶。因此，確認(rèn)重組的HYP-1蛋白具有特異的免疫活性，表明Hyp-1基因在E.coli中得到了表達(dá)。酶促反應(yīng)經(jīng)HPLC分析表明，Hyp-1確實(shí)能將大黃素催化形成金絲桃素，上述結(jié)果表明，我們克隆的Hyp-1基因確實(shí)是金絲桃素合酶基因，具備將大黃素催化形成金絲桃素的能力，從而為通過合成生物學(xué)技術(shù)來制備金絲桃素奠定了物質(zhì)基礎(chǔ)。
[Abstract]:Based on the constructed yeast two - hybrid model , the inhibitory components of non - structural protein of influenza A ( H1N1 ) and human cleavage ( CPSF30 ) can be inhibited .

Two vectors pGAL10CYCNS1 - VN and pGAL10CYCCPSF - VC were prepared by using four intermediate vectors .
Using YPD medium supplemented with glucose and galactose , the model bacteria were cultured under fluorescence microscope . The model bacteria cultured in YPD medium supplemented with galactose under the excitation of blue light showed yellow green fluorescence , whereas the model bacteria cultured with glucose showed no fluorescence , which indicates that the fluorescent protein promoter is inhibited by glucose . This lays a foundation for the selection of inhibitors to inhibit the binding of NSAs and CPSF30 .

In addition , in order to lay a theoretical basis for the future construction of two - color or multi - color fluorescence complementary model , the expression characteristics of red fluorescent protein in yeast were studied .

The expression vector pET32ahyp containing Hyp - 1 gene was constructed by continuous overlapping PCR . The results showed that the sample had bands at 36 kDa . The results showed that there was no band in the corresponding position , indicating that the Hyp - 1 gene was expressed in E . coli .
The results showed that the Hyp - 1 gene was indeed a hypericin synthase gene . The results showed that the Hyp - 1 gene was indeed a hypericin synthase gene . The results showed that the Hyp - 1 gene was indeed a hypericin synthase gene , which was capable of catalyzing emodin to form hypericin , thus providing a material basis for the preparation of hypericin by synthetic biology technique .

【學(xué)位授予單位】：山西師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號(hào)】：R373

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1757076