本文選題：單鏈抗體 + 原核表達(dá)��； 參考：《安徽醫(yī)科大學(xué)》2012年碩士論文

【摘要】：惡性腫瘤是當(dāng)今威脅人類生命健康的頭號殺手，而放射治療是治療惡性腫瘤的主要手段之一。但放射治療過程中除了具有損傷正常組織包括骨髓毒性副作用外，另外一個主要問題就是腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生放射耐受性。因此，增強腫瘤放療的輻射敏感性就成為腫瘤研究領(lǐng)域的熱點之一。 放射治療對腫瘤細(xì)胞的殺傷效應(yīng)主要是通過電離輻射誘發(fā)腫瘤細(xì)胞DNA雙鏈斷裂(DNA double strand breaks, DSBs)，從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞程序性死亡或壞死。但是細(xì)胞會對斷裂的DNA進(jìn)行修復(fù)，這是腫瘤細(xì)胞耐受輻射的主要機制之一，DNA修復(fù)能力越強，對放射的抵抗越強。哺乳動物細(xì)胞對DSBs損傷修復(fù)主要有兩條途徑，即：同源重組（homologous recombination，HR）和非同源末端連接（nonhomologous end-jioning，NHEJ）。DNA-PK （DNA-dependent protein kinase，DNA依賴的蛋白激酶）是NHEJ途徑中重要的關(guān)鍵蛋白。 DNA-PK屬于磷脂酰肌醇3-激酶相關(guān)蛋白激酶（Phosphatidylinositol-3-kinase-like kinase, PIKK）超家族成員，由調(diào)節(jié)亞單位Ku70/Ku80異源二聚體和催化亞基DNA-PKcs（DNA-dependent protein kinasecatalytic subunit）組成。DNA-PKcs在DSB修復(fù)中發(fā)揮重要作用主要是通過自磷酸化及磷酸化其他效應(yīng)蛋白，DNA-PKcs還參與細(xì)胞周期G2期調(diào)控，細(xì)胞凋亡和自吞噬死亡，并且參與V（D）J重組過程和維護端粒長度。另外，研究表明DNA-PKcs在多種癌組織中異常高表達(dá)，且具有高轉(zhuǎn)移特性和放化療耐受的癌細(xì)胞中DNA-PKcs活性顯著增高；特異性抑制DNA-PKcs可增強細(xì)胞對輻射的敏感性；表明DNA-PKcs具有作為放射增敏抗癌分子靶標(biāo)的重要價值。目前已有多種抑制劑用以抑制DNA-PKcs功能，但是這些抑制劑或特異性差、或可導(dǎo)致肝毒性、或引起免疫反應(yīng)，使其實際應(yīng)用受限。如今，人源抗體制備技術(shù)尤其是通過噬菌體抗體庫篩選單鏈抗體技術(shù)的發(fā)展，為癌癥治療的生物制藥提供了新的技術(shù)方法。 單鏈抗體是由免疫球蛋白的重鏈可變區(qū)（VH）和輕鏈可變區(qū)(VL)通過一段包含約10-25個氨基酸的連接肽連接而成的重組蛋白，是具有完全抗原結(jié)合位點的最小抗體片段。單鏈抗體具有很多優(yōu)點：分子小，免疫原性低；容易進(jìn)入實體瘤周圍的微環(huán)境；半衰期短，不易蓄積；無Fc段，不易與具有Fc受體的非靶細(xì)胞結(jié)合；易于基因操作和基因工程大量生產(chǎn)。本實驗室前期已成功地從人源化噬菌體抗體庫中篩選到針對DNA-PKcs蛋白DPK3片段(AA1960-2227)的特異性人源化單鏈抗體DPK3-scFv,并將該抗體基因轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞，得出DPK3-scFv能顯著提高其形成的腫瘤對放射治療敏感性的結(jié)果。 本研究擬通過原核表達(dá)單鏈抗體DPK3-scFv并純化后，研究其透膜進(jìn)入細(xì)胞和對DNA-PKcs自身磷酸化活性的影響，，為發(fā)展具有放射增敏作用的單鏈抗體提供依據(jù)。獲得如下主要結(jié)果： 1、運用PCR擴增目的基因HA-DPK3-scFv,并將其克隆到原核表達(dá)載體pET28a，轉(zhuǎn)化E.coli BL21(DE3)，經(jīng)優(yōu)化表達(dá)條件以包涵體形式成功表達(dá)出單鏈抗體HA-DPK3-scFv，經(jīng)過包涵體蛋白變性復(fù)性得到純化的HA-DPK3-scFv。 2、通過DNA依賴蛋白激酶分析系統(tǒng)檢測單鏈抗體HA-DPK3-scFv的蛋白活性，大容量表達(dá)純化單鏈抗體HA-DPK3-scFv，并觀察HA-DPK3-scFv的跨膜轉(zhuǎn)運；結(jié)果顯示單鏈抗體HA-DPK3-scFv未跨細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。 3、運用PCR擴增目的基因DPK3-scFv,并將其克隆到原核表達(dá)載體pET28a，轉(zhuǎn)化E.coli BL21(DE3)，經(jīng)優(yōu)化表達(dá)條件以可溶性表達(dá)形式成功表達(dá)出單鏈抗體DPK3-scFv，經(jīng)過親和層析法在體外純化出高純度的單鏈抗體DPK3-scFv，并通過DNA依賴蛋白激酶分析系統(tǒng)檢測單鏈抗體DPK3-scFv的蛋白活性。 4、將表達(dá)純化出的單鏈抗體DPK3-scFv以終濃度70μg/ml加入到培養(yǎng)基中，與腫瘤細(xì)胞孵育，通過細(xì)胞免疫熒光染色和Western blotting檢測不同時間點單鏈抗體DPK3-scFv透膜進(jìn)入細(xì)胞的狀況；結(jié)果顯示，在無血清培養(yǎng)基的培育下單鏈抗體DPK3-scFv能有效透膜進(jìn)入細(xì)胞并主要定位在細(xì)胞核中，單鏈抗體DPK3-scFv在體內(nèi)的半衰期大約是12小時。 5、基于單鏈抗體DPK3-scFv在孵育1小時后就進(jìn)入細(xì)胞的研究結(jié)果，腫瘤細(xì)胞與單鏈抗體DPK3-scFv孵育后2小時進(jìn)行4Gy γ射線處理，并通過細(xì)胞免疫熒光染色和Western blotting檢測不同時間點DNA-PKcs/pS2056磷酸化水平；結(jié)果顯示，與對照組（未與單鏈抗體DPK3-scFv孵育的腫瘤細(xì)胞）相比，單鏈抗體DPK3-scFv會使照射后的腫瘤細(xì)胞DNA-PKcs/pS2056磷酸化水平下降。 綜上所述，本課題成功表達(dá)了并純化出高濃度的針對DNA損傷修復(fù)關(guān)鍵蛋白DNA-PK的單鏈抗體DPK3-scFv，且檢測了其蛋白活性；單鏈抗體DPK3-scFv可有效透膜進(jìn)入細(xì)胞并穩(wěn)定存在；單鏈抗體DPK3-scFv抑制照射后腫瘤細(xì)胞的DNA-PKcs/pS2056磷酸化水平。
[Abstract]:Cancer is one of the leading killers threatening the health of human life , and radiotherapy is one of the primary means of treating malignant tumors . However , in addition to the side effects of bone marrow toxicity in the course of radiotherapy , one of the main problems is the radiation tolerance of tumor cells . Therefore , it is one of the hot spots in the field of tumor research to enhance the radiation sensitivity of radiotherapy .

The killing effect of radiotherapy on tumor cells is mainly caused by DNA double strand breaks ( Downs ) induced by ionizing radiation , which leads to apoptosis or necrosis of tumor cells . However , the stronger the DNA repair ability , the stronger the resistance to radiation , the stronger the ability of DNA repair , the stronger the resistance to radiation . DNA - dependent protein kinase ( DNA - dependent protein kinase ) is a key protein in the NHEJ pathway .

DNA - PKcs ( DNA - PKcs ) plays an important role in regulation of cell cycle G2 , apoptosis and autophagy of DNA - PKcs . DNA - PKcs plays an important role in regulation of cell cycle G2 , apoptosis and autophagy death , and is involved in V ( D ) J recombination process and maintenance of telomeric length .
Specific inhibition of DNA - PKcs enhances cell sensitivity to radiation ;
It is shown that DNA - PKcs has the important value as the target of radiosensitization anti - cancer molecular target . There are many inhibitors to inhibit DNA - PKcs function , but these inhibitors or specific differences may lead to liver toxicity , or cause immune response , so that its practical application is limited . Nowadays , the preparation technology of human antibody , especially the development of screening single - chain antibody technology by phage antibody library , provides a new technical method for the biological pharmacy for cancer treatment .

The single - chain antibody is a recombinant protein formed by connecting a heavy chain variable region ( VH ) and a light chain variable region ( VL ) of an immunoglobulin through a connection peptide comprising about 10 to 25 amino acids , and is a minimum antibody fragment having a complete antigen binding site .
easy access to the microenvironment around the solid tumor ;
the half - life is short and is not easy to accumulate ;
no Fc fragment is difficult to bind to non - target cells with Fc receptors ;
The specific humanized single chain antibody DPK3 - scFv against DNA - PKcs protein DPK3 fragment ( AA1960 - 2227 ) was successfully screened from humanized phage antibody library , and the antibody gene was transfected into HeLa cells .

In order to develop a single - chain antibody with radiosensitivity , it is proposed to study the influence of its permeable membrane on the phosphorylation of DNA - PKcs by prokaryotic expression of single - chain antibody DPK3 - scFv . The results are as follows :

1 . The HA - DPK3 - scFv was amplified by PCR and cloned into the prokaryotic expression vector pET28a . The recombinant plasmid pET28a was transformed into E . coli BL21 ( DE3 ) . The HA - DPK3 - scFv was successfully expressed in inclusion body by the optimized expression condition , and the purified HA - DPK3 - scFv was purified by inclusion body protein denaturation .

2 , detecting the protein activity of the single - chain antibody HA - DPK3 - scFv by a DNA - dependent protein kinase assay system , expressing and purifying the single - chain antibody HA - DPK3 - scFv in large capacity , and observing the transmembrane transport of the HA - DPK3 - scFv ;
The results showed that the single chain antibody HA - DPK3 - scFv did not enter the cell membrane across the cell membrane .

3 . The target gene DPK3 - scFv was amplified by PCR and cloned into E . coli BL21 ( DE3 ) . The single - chain antibody , DPK3 - scFv , was successfully expressed in soluble form by optimized expression conditions , and the high - purity single - chain antibody DPK3 - scFv was purified by affinity chromatography in vitro , and the protein activity of single - chain antibody DPK3 - scFv was detected by DNA - dependent protein kinase assay .

4 . The purified single - chain antibody DPK3 - scFv was added to the culture medium at a final concentration of 70.mu . g / ml , incubated with tumor cells , and the conditions of entry of the single - chain antibody DPK3 - scFv permeable membrane at different time points were detected by cell immunofluorescence staining and Western blotting ;
The results showed that the single - chain antibody DPK3 - scFv was able to effectively penetrate into the cell and mainly locate in the nucleus without serum - free medium , and the half - life of single - chain antibody DPK3 - scFv in vivo was about 12 hours .

5 . After 1 hour incubation of single - chain antibody DPK3 - scFv , the tumor cells were treated with 4Gy 緯 - ray at 2 hours after incubation with single chain antibody DPK3 - scFv , and the phosphorylation level of DNA - PKcs / pS2056 was detected by immunofluorescence staining and Western blotting .
The results showed that the single - chain antibody DPK3 - scFv decreased the phosphorylation level of DNA - PKcs / pS2056 after irradiation compared to the control group ( tumor cells not incubated with single - chain antibody DPK3 - scFv ) .

In conclusion , the single - chain antibody DPK3 - scFv with high concentration of DNA - PK for DNA damage repair was successfully expressed and purified , and its protein activity was detected .
Single - chain antibody DPK3 - scFv can effectively penetrate into cells and stably exist ;
Single - chain antibody DPK3 - scFv inhibited the phosphorylation of DNA - PKcs / pS2056 of tumor cells after irradiation .

【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號】：R392

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本文編號：1754030