本文選題：外排 + 轉(zhuǎn)運(yùn)��； 參考：《鄭州大學(xué)》2011年碩士論文

【摘要】：目的 幽門螺桿菌(Helicobacter pylori, H.pylori)在人群中感染率在40-90%,它是慢性胃炎、消化性潰瘍和胃粘膜相關(guān)淋巴組織淋巴瘤的主要病因,并與胃癌的發(fā)生密切相關(guān).臨床中常聯(lián)合應(yīng)用抗生素對(duì)幽門螺桿菌進(jìn)行根除治療.隨著抗生素的廣泛應(yīng)用,幽門螺桿菌的耐藥率逐年上升,并且已經(jīng)出現(xiàn)同時(shí)對(duì)阿莫西林、克拉霉素和甲硝唑耐藥的多重耐藥(multi-drug resistance)株.目前針對(duì)細(xì)菌多重耐藥的機(jī)制研究已成為細(xì)菌耐藥性研究中的熱點(diǎn)問題.其中,細(xì)菌外排泵(efflux pump)在多重耐藥中起重要作用。外排泵是細(xì)菌體內(nèi)能將有害底物泵出體外的一類轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,可分為5個(gè)家族。 國內(nèi)外和我們前期對(duì)RND類外排泵在幽門螺桿菌多重耐藥中作用的機(jī)制研究已有報(bào)道,但對(duì)于ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因在幽門螺桿菌多重耐藥株中的表達(dá)及其作用尚需進(jìn)一步研究.本研究在我們前期研究的基礎(chǔ)上,從GenBank篩選出ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族基因中的兩個(gè)典型的多重耐藥蛋白基因msbA和spab,測(cè)定其在幽門螺桿菌多重耐藥株中的表達(dá),并構(gòu)建對(duì)應(yīng)的基因敲除株,測(cè)定敲除前后對(duì)應(yīng)菌株對(duì)各種抗生素的敏感性,研究兩種基因在幽門螺桿菌多重耐藥中的作用.進(jìn)一步闡明在幽門螺桿菌多重耐藥起作用的外排泵的種類和意義,為臨床上幽門螺桿菌多重耐藥的研究打下理論基礎(chǔ)。 方法 1.從臨床胃炎和消化性潰瘍病人胃粘膜標(biāo)本分離培養(yǎng)出幽門螺桿菌野生菌株,測(cè)定菌株對(duì)各種抗生素的MIC。 2.應(yīng)用氯霉素在敏感野生株中誘導(dǎo)出對(duì)應(yīng)的幽門螺桿菌多重耐藥株,并采用瓊脂二倍稀釋法測(cè)定敏感株和多重耐藥菌株對(duì)各種抗生素的MIC。 3.PCR檢測(cè)幽門螺桿菌野生株中msbA和spab基因的表達(dá)。 4.應(yīng)用RT-PCR分別測(cè)定msbA和spab基因在野生敏感株和誘導(dǎo)多重耐藥株中的表達(dá)。 5.分別構(gòu)建msbA和spab的基因敲除株,并測(cè)定基因敲除前后對(duì)9種抗生素的MIC。 結(jié)果 1.成功從臨床上分離培養(yǎng)出幽門螺桿菌野生株50株。將臨床分離的4株敏感株和標(biāo)準(zhǔn)株HpNCTC 11637經(jīng)氯霉素誘導(dǎo),成功誘導(dǎo)出對(duì)應(yīng)的多重耐藥株5株,經(jīng)瓊脂二倍稀釋法測(cè)定5株多重耐藥株對(duì)氨芐西林、頭孢菌素、四壞素、克拉霉素、氧氟沙星和呋喃嘩酮的MIC相對(duì)于敏感株均有不同程度的提高。 2.隨機(jī)選擇20株臨床分離株,均檢測(cè)出msbA和spab基因,大小分別為303bp和424bp,未發(fā)現(xiàn)兩種基因的缺失株。 3.多重耐藥株中msbA和spab基因的相對(duì)表達(dá)量明顯高于野生敏感株(msbA:多重耐藥株1.8200±0.5310 vs敏感株0.8420±0.0789,P=0.018；spab多重耐藥株1.8340±0.2726 vs敏感株1.2180±0.0743,P=0.015)。 4.成功構(gòu)建了msbA和spab的基因敲除株(HpMZ1006△msbA和HpMZ1006△spab)。HpMZ1006△msbA和HpMZ1006△spab對(duì)于四種抗生素(克拉霉素、氯霉素、氧氟沙星和利福平)的MIC相對(duì)敲除前野生株有明顯下降。 結(jié)論 1.在氯霉素的長期次抑菌濃度誘導(dǎo)下,敏感的幽門螺桿菌菌株轉(zhuǎn)變?yōu)槎嘀啬退幘?說明抗生素的長期濫用和劑量不足會(huì)導(dǎo)致耐藥菌株的產(chǎn)生。 2.ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白msbA和spab基因在幽門螺桿菌中普遍存在。 3.ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白msbA和spab基因在幽門螺桿菌多重耐藥機(jī)制中起重要作用。 4.首次闡明了在幽門螺桿菌多重耐藥機(jī)制中,除了RND家族外排泵起作用之外,還有ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白外排泵家族參與其中。 5.由于ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白外排泵家族在能量來源與其他外排泵家族不同,為以后新型外排泵抑制劑的研發(fā)提供了理論基礎(chǔ)。
[Abstract]:objective
Helicobacter pylori (Helicobacter pylori, H.pylori) in the 40-90% infection rate in the population, it is the main cause of chronic gastritis, peptic ulcer and gastric mucosa associated lymphoid tissue lymphoma, and is closely related with the occurrence of gastric cancer. The clinical often combined application of antibiotics on Helicobacter pylori eradication therapy. With the widespread use of antibiotics. The resistance rate of Helicobacter pylori increased year by year, and has appeared at the same time of amoxicillin, clarithromycin and metronidazole resistance of multidrug resistant strains (multi-drug resistance). The mechanism of multi drug resistant bacteria has become a hot issue in the study of bacterial resistance. The bacterial efflux pump (efflux pump) plays an important role in multi drug resistance efflux pump. Bacteria can be harmful to the substrate is a kind of pump transport protein in vitro, can be divided into 5 families.
At home and abroad and our previous studies on RND efflux function in multidrug resistance of Helicobacter pylori mechanism have been reported, but for the ABC transporter gene expression and its role in multidrug resistance of Helicobacter pylori strains need further study. This study is based on our previous studies, selected ABC transporter family gene in two typical multidrug resistance protein gene msbA and SPAB from GenBank, its expression in multidrug resistance of Helicobacter pylori strains in the determination, and construct the corresponding gene knockout strains, determination of knockout strains to various antibiotics and the corresponding sensitivity effect of two genes in multidrug resistance of Helicobacter pylori the variety and significance. To further clarify the role in multidrug resistance of Helicobacter pylori pumps, lay the theoretical foundation for clinical research on multidrug resistance of Helicobacter pylori.
Method
1. from clinical gastritis and peptic ulcer patients with gastric mucosa specimens isolated from wild strains of Helicobacter pylori, determination of MIC. strains to various antibiotics
Multidrug resistance of Helicobacter pylori strains in the 2. application of chloramphenicol sensitive strains induced in the corresponding, and using two - fold agar dilution method strains to various antibiotics MIC.
Detection of 3.PCR expression of Helicobacter pylori msbA and SPAB genes in wild strains.
4. application of RT-PCR were measured by the msbA and SPAB genes in wild sensitive strains and multi drug resistant strains induced expression.
5. construction of msbA and SPAB gene knockout strains and determination of gene knockout of MIC. to 9 kinds of antibiotics before and after
Result
1. successfully isolated Helicobacter pylori strains of 50 wild strains from clinical. The clinical isolates of 4 strains of sensitive strains and standard strain HpNCTC 11637 was induced by chloramphenicol, successfully induced the corresponding multi drug resistant strains of 5, by two fold agar dilution method for determination of 5 strains of multi drug resistant strains to ampicillin, cephalosporins, four bad elements compared with ofloxacin and clarithromycin, furan ketones wow MIC sensitive strains had different degrees of improvement.
2. randomly selected from 20 clinical isolates were detected in msbA and SPAB genes, the size were 303bp and 424bp, were found two gene deletion strains.
The relative expression of 3. multidrug-resistant msbA and SPAB strain gene was significantly higher than that of wild strains (msbA: 1.8200 + 0.5310 multiple drug resistant strains of vs sensitive strains of 0.8420 + 0.0789, P=0.018; 1.8340 SPAB multiple drug resistant strains of vs sensitive strains of 1.2180 + 0.2726 + 0.0743, P=0.015).
4. msbA was successfully constructed and SPAB gene knockout strains (HpMZ1006 msbA and HpMZ1006 SPAB) and HpMZ1006.HpMZ1006 Delta msbA Delta SPAB to four kinds of antibiotics (clarithromycin and ofloxacin, chloramphenicol, rifampicin) relative MIC knockout before the wild strain decreased significantly.
conclusion
1. in the long term of chloramphenicol subinhibitory concentration induced by Helicobacter pylori strains sensitive to multiple antibiotic resistant strains, indicating that the long-term antibiotic abuse and insufficient dose will lead to the emergence of resistant strains.
2.ABC transporter msbA and SPAB gene exists in Helicobacter pylori.
3.ABC transporter msbA and SPAB gene play an important role in the mechanism of multidrug resistance of Helicobacter pylori.
4. for the first time to clarify the mechanism of multidrug resistance in Helicobacter pylori, in addition to the RND family of efflux pump function, and ABC transporter efflux pump family involved.
5. because of the ABC transporter family of efflux pump in energy sources and other efflux pump family, provides a theoretical basis for the development of new type of efflux pump inhibitors.

【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號(hào)】：R378

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本文編號(hào)：1753547