本文選題：細胞編程 + 逆轉(zhuǎn)錄病毒��； 參考：《南方醫(yī)科大學》2012年博士論文

【摘要】：研究背景和目的 心血管疾病是威脅人類健康的“頭號殺手”,占疾病死亡原因的35%,而心肌梗死和心力衰竭是心血管疾病死亡的主要原因。心肌梗死是由于冠狀動脈血管閉塞,導(dǎo)致心臟血液供應(yīng)中斷,形成以心肌細胞損傷、壞死為特征的疾病。心力衰竭是心肌細胞收縮和(或)舒張功能障礙,引起心輸出量降低為特征的一類疾病。心肌梗死患者由于冠狀動脈血管閉塞導(dǎo)致梗死區(qū)域內(nèi)的心肌細胞壞死,周圍缺血區(qū)域內(nèi)的心肌細胞損傷,部分心肌細胞發(fā)生凋亡,從而造成有功能心肌細胞數(shù)目減少,由于心肌細胞缺乏必要的增殖分化能力,只能由成纖維細胞填充替代,形成瘢痕組織、心室壁變薄、室壁瘤形、心室重構(gòu)、心臟收縮舒張功能減退、心電活動紊亂等原因,最終可導(dǎo)致患者死亡。目前實施的藥物靜脈溶栓治療、冠狀動脈介入治療、冠狀動脈旁路搭橋手術(shù),心力衰竭再同步化治療均無法使已經(jīng)壞死或纖維化的心肌細胞恢復(fù)正常功能。心臟移植雖然是晚期心力衰竭最有效的方法,但是面臨著供體器官短缺、醫(yī)療費用昂貴、手術(shù)要求高、自體免疫排斥反應(yīng)等一系列的問題,因此,在臨床實踐過程中受到了很大限制。干細胞是一種未分化的多潛能細胞,具有自我更新、無限增殖和多向分化潛能,干細胞移植治療可以修復(fù)損傷壞死心肌細胞,為心血管疾病患者的治療帶來新的希望,如心肌梗死、心力衰竭、心肌病、完全性房室傳導(dǎo)阻滯及病態(tài)竇房結(jié)綜合癥等患者。 1981年Evnas和Martin研究小組首先建立了小鼠胚胎干細胞系,1998年Thomson和Shamblott研究小組分別利用人類體外受精囊胚和流產(chǎn)胎兒首次建立人類胚胎干細胞(Embryonic stem cells,ES)。隨后一些研究發(fā)現(xiàn)人類胚胎干細胞可以被誘導(dǎo)分化為神經(jīng)細胞、平滑肌細胞、心肌細胞、造血細胞等200多種細胞。1999年Bjornson等將鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)干細胞橫向分化為血細胞,進一步證明了成體干細胞同樣具有橫向分化潛能。根據(jù)干細胞的不同發(fā)育階段,目前可將其劃分為：①胚胎干細胞；②成體干細胞,包括造血干細胞、骨髓間質(zhì)干細胞、肌肉干細胞、脂肪干細胞等。根據(jù)干細胞的分化潛能,又可將其劃分為：①全能干細胞；②多能干細胞；③單能干細胞。胚胎干細胞和成體干細胞是干細胞移植治療心血管疾病的兩種候選細胞。胚胎干細胞為多潛能干細胞,可以分化為多種類型的心肌細胞,因受到倫理學問題的限制,目前僅限于動物實驗。成體干細胞具有橫向分化潛能,在一定條件下培養(yǎng)可以分化為心肌細胞。患者自身成體干細胞移植克服了免疫排斥反應(yīng)和倫理學問題的爭論,是干細胞移植治療心血管疾病的種子細胞,但是,在臨床應(yīng)用過程中也面臨著許多問題有待于進一步解決。 細胞編程是將已分化成熟的體細胞在體外編程后,將其逆轉(zhuǎn)為一種未分化狀態(tài),被逆轉(zhuǎn)后的細胞具有多能性。細胞多能性是指其能夠分化為機體內(nèi)多種細胞類型的潛能。誘導(dǎo)性多潛能干細胞是近年來干細胞領(lǐng)域的研究熱點。2006年8月日本京都大學Yamanaka研究小組首次將小鼠成纖維細胞誘導(dǎo)為多潛能干細胞(Induced pluripotent stem cells,iPS),簡稱"iPS細胞”。iPS細胞是將已分化成熟體細胞重編程為類似于胚胎干樣細胞(Embryonic Stem Cells,ES)。iPS細胞不僅在細胞形態(tài)、表面抗原、基因表達、增殖及分化潛能方面類似于胚胎干細胞,而且,擺脫了圍繞人類胚胎干細胞使用問題的政治和倫理爭論,避免了患者異體干細胞移植引起的免疫排斥反應(yīng)等優(yōu)點,為干細胞移植治療心血管疾病提供了新的思路和方法。建立iPS細胞大致包括以下主要環(huán)節(jié)：①選擇體細胞及編程因子；②將編程因子轉(zhuǎn)染入體細胞內(nèi)；③體細胞的培養(yǎng)和編程；④iPS細胞的篩選；⑤iPS細胞的鑒定。 2009年我國科學家利用四倍體囊胚注射法得到了iPS細胞來源的小鼠,首次證明了iPS細胞具有多向分化潛能。這一研究成果表明,iPS細胞可以分化為所有類型的心臟細胞,可用于心血管疾病的干細胞治療。干細胞移植治療心血管疾病的種子細胞應(yīng)該具備以下特點：①來源充足,取材方便,易被患者接受；②移植后患者無自身免疫排斥反應(yīng),并具有良好的生物安全性；③無社會倫理學問題的爭議。本實驗首先,利用酶消化法原代培養(yǎng)UMC細胞,組織塊貼壁法原代培HSF細胞。其次,以逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)系統(tǒng)作為外源性基因(Sox2、K1f4、Oct4、c-Myc)轉(zhuǎn)移載體,將UMC細胞和HSF細胞體外誘導(dǎo)為iPS細胞。最后,對建立的iPS細胞系進行基因表達量檢測、細胞核型分析、ES細胞特異性蛋白質(zhì)檢測、體內(nèi)分化畸胎瘤、體外分化擬胚體等實驗,對iPS細胞的生物學特性進行鑒定。 研究方法 1人誘導(dǎo)性多潛能干細胞的建立 1.1原代培養(yǎng)UMC和HSF細胞手術(shù)切取正常新生兒臍帶(1例)和急性心肌梗死患者皮膚(1例),利用酶消化法原代分離培養(yǎng)UMC細胞,組織塊貼壁法原代分離培養(yǎng)HSF細胞。 1.2制備CF-1小鼠胚胎成纖維細胞(MEF)滋養(yǎng)層選擇一只孕13.5天CF-1小鼠,分離胚胎組織,用剪刀將其剪碎,利用0.15%胰酶消化15分鐘,分離成纖維細胞。擴增原代培養(yǎng)的MEF細胞至P3代,應(yīng)用10ug/ml濃度的絲裂霉素C工作液處理P3代細胞3小時。最后將新制備的MEF飼養(yǎng)層細胞進行凍存,以備日后應(yīng)用。 1.3包裝生產(chǎn)逆轉(zhuǎn)錄病毒復(fù)蘇凍存293T細胞,細胞生長密度達100%進行分盤,質(zhì)粒轉(zhuǎn)染前分盤后293T細胞生長密度應(yīng)達到80%-85%左右。應(yīng)用磷酸鈣法將pMX-hOCT-4、pMX-hSOX-2、pMX-hKLF-4、pMX-hc-MYC、pMX-GFP及pCL包裝質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染到293T細胞內(nèi),12-16小時更換培養(yǎng)液,包裝生產(chǎn)攜帶外源性目的基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒上清液,36-48小時收集病毒感染UMC和HSF細胞。 1.4收集病毒感染UMC和HSF細胞復(fù)蘇凍存UMC和HSF細胞,按4×104/每孔密度將UMC和HSF細胞分盤到六孔板中。收集包裝生產(chǎn)逆轉(zhuǎn)錄病毒上清液,經(jīng)0.45um濾過膜過濾,加入polybrene(8ug/ml)混勻,分別感染UMC和HSF細胞。 1.5病毒感染后UMC和HSF細胞培養(yǎng)病毒感染第2天將細胞培養(yǎng)基更換為DFBS培養(yǎng)基,第6天將感染后的UMC和HSF細胞接種到MEF飼養(yǎng)層細胞培養(yǎng),第18天將DFBS培養(yǎng)基更換為KSR培養(yǎng)基。 1.6挑取iPS細胞克隆挑取iPS細胞克隆前一天,復(fù)蘇MEF飼養(yǎng)層細胞到12孔板,第2天更換為KSR培養(yǎng)基。挑取iPS細胞克隆前,制作圓頭和斷口吸管,在顯微鏡下選取形態(tài)上類似于ES樣的iPS細胞,應(yīng)用圓頭吸管切割細胞克隆,用斷頭吸管將切割好的細胞克隆吸出,移入鋪有MEF飼養(yǎng)層的12孔板中 1.7飼養(yǎng)層和無飼養(yǎng)層培養(yǎng)系統(tǒng)培養(yǎng)iPS細胞將被挑取的iPS細胞克隆接種到MEF飼養(yǎng)層細胞進行純化和擴增培養(yǎng)。將在飼養(yǎng)層細胞培養(yǎng)的iPS細胞,再接種到無飼養(yǎng)層培養(yǎng)系統(tǒng)進行培養(yǎng),提取iPS細胞DNA和RNA檢測細胞基因表達量水平。 2人誘導(dǎo)性多潛能干細胞的鑒定 2.1基因表達量應(yīng)用RT-PCR方法檢測iPS細胞外源性基因Sox2、Klf4、 c-Myc和內(nèi)源性基因Oct4、Rex1、Sox2的相對表達量。 2.2外源性基因插入鑒定應(yīng)用1%瓊脂糖凝膠電泳法鑒定外源性基因Sox2、Klf4、Oct4、c-Myc是否被插入到iPS細胞核內(nèi)。 2.3iPS細胞核型分析應(yīng)用G顯帶核型分析法對iPS細胞進行核型分析,判斷體細胞被重編程為iPS細胞后能否保持正常的細胞核型。 2.4iPS細胞堿性磷酸酶(Alkaline phosphatasee, AP)染色檢測iPS細胞堿性磷酸酶活性。 2.5iPS細胞免疫熒光染色檢測iPS細胞是否表達ES細胞特異性膜蛋白(SSEA3、SSEA4)、質(zhì)蛋白(TRA-1-60、TRA-1-81)和核蛋白(Nanog) 2.6Nanog、Oct4甲基化測序應(yīng)用DNA甲基化測序法檢測iPS細胞的Nanog、Oct4基因是否發(fā)生了去甲基化反應(yīng)。 2.7體內(nèi)分化畸胎瘤實驗將iPS細胞分別注射到SCID小鼠背部和大腿內(nèi)側(cè),兩個月后觀察是否有畸胎瘤形成,并對形成的畸胎瘤實體進行組織切片蘇木精-伊紅染色(Hematoxylin-eosin staining, HE)判斷iPS細胞是否具有向三胚層組織細胞分化的潛能。 2.8體外分化擬胚體實驗iPS細胞在體外先懸浮培養(yǎng)形成擬胚體,然后進行貼壁擴增培養(yǎng)。裂解擬胚體細胞提取細胞RNA,應(yīng)用RT-PCR方法檢測內(nèi)源性基因(Nanog、Oct-4)、內(nèi)胚層基因(AFP、GATA4、SOX17)、中胚層基因(TBX1)、外胚層基因(PAX6、SOX1)的相對表達量。 研究結(jié)果 1iPS細胞的建立 1.1原代培養(yǎng)UMC、HSF細胞利用酶消化法在體外成功分離培養(yǎng)出UMC細胞,應(yīng)用皮膚組織塊貼壁法在體外成功分離培養(yǎng)出HSF細胞。 1.2制備MEF飼養(yǎng)層細胞應(yīng)用絲裂霉素C處理P3代CF-1小鼠胚胎成纖維細胞3小時。鏡下觀察細胞形態(tài)未發(fā)生改變、細胞無大量死亡、細胞數(shù)量未增加,表明細胞在保持生存能力的同時,細胞增殖能力又受到了有效抑制。 1.3包裝生產(chǎn)逆轉(zhuǎn)錄病毒應(yīng)用磷酸鈣法成功的將外源性基因Sox2、Klf4、 Oct4、c-Myc轉(zhuǎn)染到293T細胞內(nèi),293T細胞包裝生產(chǎn)攜帶目的基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒上清液。 1.4收集病毒感染UMC和HSF細胞收集包裝生產(chǎn)的逆轉(zhuǎn)錄病毒上清液分兩次感染UMC和HSF細胞,體細胞成功的被攜帶目的基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒上清液感染。 1.5病毒感染后UMC和HSF細胞培養(yǎng)病毒感染細胞第4-5天,UMC和HSF細胞形態(tài)發(fā)生改變,呈類圓形,細胞發(fā)生聚集；第10-12天,在MEF飼養(yǎng)層細胞培養(yǎng)的UMC和HSF細胞出現(xiàn)iPS樣細胞克隆增生；隨著細胞培養(yǎng)時間的推移,iPS細胞克隆體積不斷增大、邊緣清晰,周圍有較多雜細胞。 1.6挑取iPS細胞克隆病毒感染第28-30天,在顯微鏡下分別挑取5株UMC和3株HSF細胞來源的iPS細胞克隆,分別命名為UMC-iPS-C1、 UMC-iPS-C2、UMC-iPS-C3、UMC-iPS-C4、UMC-iPS-C5、HSF-iPS-C1、 HSF-iPS-C2、HSF-iPS-C3。 1.7飼養(yǎng)層和無飼養(yǎng)層培養(yǎng)系統(tǒng)培養(yǎng)iPS細胞iPS細胞生長狀態(tài)良好,細胞呈球形,形態(tài)均一,克隆聚集成團,邊緣整齊。在iPS細胞培養(yǎng)過程中,及時處理了已發(fā)生分化、衰老和死亡的iPS細胞。 2iPS細胞的鑒定 2.1iPS細胞基因相對表達量①iPS細胞內(nèi)源性多能基因Nanog、Oct4、 Rex1、Sox2的相對表達量,明顯高于編程前UMC和HSF細胞,并與ES細胞基因表達譜相類似。②外源性編程基因Sox2、Klf4、Oct4、c-Myc在iPS細胞表達量明顯低于病毒感染第6天的UMC和HSF細胞,其中,UMC-iPS-C2、 UMC-iPS-C3、HSF-iPS-C1、HSF-iPS-C3細胞克隆外源性基因沉默相對較好,被選入下一輪的iPS細胞鑒定實驗。 2.2外源性基因插入鑒定1%瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果陽性,表明外源性基因Sox2、Klf4、Oct4、c-Myc被插入到iPS細胞核內(nèi)。 2.3iPS細胞核型分析G帶核型分析結(jié)果顯示,4株iPS細胞系均為46條染色體、XY型,細胞核型均正常。 2.4AP染色①挑取iPS細胞克隆后,對剩余細胞進行AP染色,初步判斷本次實驗UMC和HSF細胞編程效率分別為1.84%和0.89%。②對在MEF飼養(yǎng)層細胞培養(yǎng)的iPS細胞進行AP染色,iPS細胞被染成深紫色為陽性；飼養(yǎng)層細胞和其它細胞被染色粉紅色或沒被染色為陰性。 2.5ES細胞特異性蛋白質(zhì)表達檢測iPS細胞抗原抗體免疫熒光反應(yīng),膜蛋白(SSEA3、SSEA4)被染成紫藍色,質(zhì)蛋白(TRA-1-60、TRA-1-81),核蛋白(Nanog)被染成藍綠色,細胞染色均為陽性,說明iPS細胞表達ES細胞特異性蛋白質(zhì)。 2.6Nanog、Oct4基因甲基化測序細胞編程前UMC和HSF細胞內(nèi)源性基因Nanog、Oct-4處于甲基化狀態(tài),而細胞被編程為iPS細胞后,Nanog、Oct-4基因發(fā)生了去甲基化反應(yīng)。 2.7畸胎瘤實驗及組織切片檢查四株iPS細胞被注射到SCID小鼠體內(nèi)均形成畸胎瘤實體,組織切片HE染色顯示包含內(nèi)胚層、中胚層、外胚層組織細胞。 2.8擬胚體實驗及基因相對表達量iPS細胞在體外懸浮培養(yǎng),細胞聚集成團塊狀,形成擬胚體,再貼壁培養(yǎng)細胞團塊。裂解細胞提取RNA, RT-PCR檢測結(jié)果顯示,內(nèi)源性基因Nanog、Oct4表達量降低,內(nèi)胚層基因(AFP、GATA4、 SOX17)、中胚層基因(TBX1)、外胚層基因(PAX6、SOXl)表達量發(fā)生明顯差異。 研究結(jié)論 1以O(shè)ct-4、Sox-2、c-Myc、Klf-4作為編程基因,通過逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因技術(shù),成功的將原代培養(yǎng)UMC和HSF細胞在體外誘導(dǎo)為iPS細胞。 2對iPS細胞的生物學鑒定顯示,細胞在形態(tài)學、基因相對表達量、堿性磷酸酶活性、ES細胞特異性蛋白質(zhì)表達及細胞分化潛能等方面類似于ES細胞。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2012
【分類號】：R329

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本文編號：1742372