本文選題：Rap1 + 生精細胞�。� 參考：《第四軍醫(yī)大學》2012年博士論文

【摘要】：目的 Rap1是一種在真核生物廣泛表達的GTP結(jié)合蛋白，參與著體內(nèi)多種生物學活動。不同于其它GTP結(jié)合蛋白的是其在人胚腎以及部分腫瘤細胞中可被誘導入核。在之前研究中我們已經(jīng)證實其在不育男性生精細胞中表達升高。推測其可能參與調(diào)節(jié)生精細胞的增殖和分化，調(diào)控精子的發(fā)生，為進一步明確Rap1在生精過程中的作用，我們研究了其在大鼠睪丸發(fā)育以及生精細胞凋亡模型中的表達，對其可能的作用機制進行了探討。 方法 1.使用不同固定試劑固定大鼠生精細胞各發(fā)育階段（1，7，15，24，37，50和90天）的睪丸組織，進行免疫組織化學染色，了解Rap1在發(fā)育中的表達規(guī)律并分析固定試劑對其表達的影響。結(jié)合使用蛋白質(zhì)免疫印跡研究Rap1在總體睪丸的表達水平。 2.使用單劑量MAA(650mg/kg)腹腔注射建立大鼠精母細胞凋亡模型，采用免疫組織化學、TUNEL、蛋白質(zhì)免疫印跡雜交研究Rap1在生精細胞凋亡過程中表達的變化，并使用間接免疫熒光、免疫共沉淀研究Rap1與NF-κB的相互作用關(guān)系。 結(jié)果 1.在Bouin’s液固定的大鼠睪丸組織中，P1和P7生精細胞有Rap1表達，從P15開始，Rap1表達于精母細胞核旁的高爾基體，，隨著大鼠繼續(xù)發(fā)育，Rap1在高爾基體表達逐漸增強，并在成年后大鼠精母及圓形精子細胞核旁出現(xiàn)Rap1表達。Rap1表達隨著粗線期精母細胞高爾基體的增大而增高。 2.在多聚甲醛固定的大鼠睪丸組織中，P1生殖母細胞和P7精原細胞的胞核強表達Rap1，而P7每個生精小管的陽性細胞數(shù)顯著低于P1(P 0.001)。Rap1在P15大鼠生精小管內(nèi)主要表達于精原細胞胞漿。在P24、P37、P50表達在晚粗線期精母細胞核內(nèi)。在P90大鼠睪丸中，Rap1在各種細胞無顯著著色區(qū)域。在睪丸除生精細胞以外的其它細胞未發(fā)現(xiàn)Rap1表達。 3.在睪丸組織蛋白免疫印跡研究中，Rap1在P1仔鼠睪丸組織裂解物中的表達顯著高于P7(P 0.01)。其它各時間點表達無顯著差異。 4.在MAA腹腔注射6h大鼠睪丸中，Rap1、NF-κB以及TUNEL染色陽性的粗線期精母細胞在VIII-XIV期小管內(nèi)開始出現(xiàn)，到12h及24h陽性細胞數(shù)明顯增多。睪丸組織蛋白免疫印跡研究提示，各處理組與對照組間睪丸Rap1及NF-κB的表達量無顯著差異。 5. Rap1間接免疫熒光加TUNEL染色提示：MAA處理后，各時間點在VIII-XIV期生精小管可見Rap1與TUNEL細胞核內(nèi)共定位的細胞百分比分別為19.1%、57.7%、67.4%，各處理組Rap1+TUNEL陽性細胞數(shù)顯著高于對照組(P 0.01)。 6. Rap1和NF-κB雙標記間接免疫熒光提示在實驗組，兩種蛋白在VIII-XIV期粗線期精母細胞核內(nèi)共定位細胞百分率分別為75.6%、91.8%、94.6%，高于RAP1與TUNEL共表達的百分比。對MAA處理24h及對照大鼠睪丸蛋白進行NF-κB與Rap1免疫共沉淀分析提示，MAA處理組NF-κB結(jié)合的蛋白中Rap1的表達明顯強于對照組。 結(jié)論 1. Rap1在大鼠睪丸發(fā)育過程中表達于生精細胞的胞核和高爾基體，可能參與了睪丸發(fā)育過程中生精細胞的基因調(diào)控。固定試劑的選擇會影響Rap1的免疫組化顯色結(jié)果。 2. Rap1和NF-κB在MAA誘導的凋亡的生精細胞中表達明顯升高，并且均發(fā)生入核并共定位，免疫共沉淀結(jié)果提示兩種蛋白存在相互作用，提示Rap1可能與NF-κB相互作用介導生精細胞凋亡。
[Abstract]:objective
Rap1 is a widely expressed in eukaryotic GTP binding protein involved in various biological activities. Different from other GTP binding proteins can be induced into the nucleus in human embryonic kidney cells and some tumor. In previous studies we have confirmed the increased expression of spermatogenic cells in infertile men. It is hypothesized to be involved in the regulation of proliferation and differentiation of spermatogenic cells, regulation of spermatogenesis, to further clarify the role of Rap1 in spermatogenesis, we studied its expression in rat testis development and apoptosis of spermatogenic cells in the model, the possible mechanism was discussed.
Method
The use of 1. different fixation reagent immobilized rats at different developmental stages of germ cells (1,7,15,24,37,50 and 90 days) of the testis tissue by immunohistochemical staining, understand the expression pattern of Rap1 in development and analysis of the impact of fixed reagents on the expression of binding protein. Immunoblotting studies using the Rap1 expression level in whole testis.
2. using a single dose of MAA (650mg/kg) on apoptosis of rat spermatocyte cell model was established by intraperitoneal injection, immunohistochemistry, TUNEL, Western blot the expression of Rap1 in apoptosis of spermatogenic cells in the process, and the use of indirect immunofluorescence and immunoprecipitation studies the interaction between Rap1 and NF- K B.
Result
1. in Bouin 's was fixed in rat testicular tissue, P1 and P7 in spermatogenic cells with expression of Rap1, P15 from the beginning, Golgi Rap1 expressed in spermatocytes by the rats with continued development, the expression of Rap1 in the Golgi gradually increased, and in the adult rat spermatocytes and round sperm near Rap1 daughter nucleus.Rap1 expression increases with the increase of pachytene spermatocytes Golgi body.
In 2. paraformaldehyde fixed rat testis, P1 germ cells and P7 spermatogonia nucleus strong expression of Rap1 and P7, the number of positive cells per seminiferous tubules was significantly lower than that of P1 (P 0.001).Rap1 P15 in rat seminiferous tubule mainly expressed in spermatogonia cytoplasm. In P24, P37, P50 expression in late pachytene spermatocytes in the nucleus. In the testis of P90 rats, Rap1 had no significant color regions in a variety of cells. Other cells in testis except spermatogenic cells showed Rap1 expression.
3. in the Western blot study of testicular tissue, the expression of Rap1 in lysates of P1 offspring was significantly higher than that of P7 (P 0.01). No significant difference was found in other time points.
4. in the testis of 6h rats by intraperitoneal injection of MAA, Rap1, NF- kappa B and TUNEL positive pachytene spermatocytes appeared in VIII-XIV tubules, 12h and 24h positive cells increased significantly. The Western blot of testicular tissue suggest that there was no significant difference between the expression of each treatment group and control group testis Rap1 and NF- K B.
5. Rap1 indirect immunofluorescence and TUNEL staining indicated that after MAA treatment at different time points in the percentage of VIII-XIV phase cells of seminiferous tubules and TUNEL Rap1 visible nucleus co localization were 19.1%, 57.7%, 67.4%, the number of Rap1+TUNEL positive cells in each treatment group was significantly higher than the control group (P 0.01).
6. Rap1 and NF- K B double labeling immunofluorescence indicated in the experimental group, two proteins in the VIII-XIV phase of pachytene spermatocytes in the co localization of cell percentage were 75.6%, 91.8%, 94.6%, the percentage is higher than that of RAP1 and TUNEL co expression of MAA and 24h. The control rat testis protein NF- kappa B and Rap1 analysis showed that the expression of immune co precipitation, MAA treatment group Rap1 NF- B binding protein is significantly stronger in the control group.
conclusion
1., Rap1 is expressed in the nuclei and Golgi bodies of spermatogenic cells during the development of rat testis. It may be involved in the gene regulation of spermatogenic cells during testicular development. The selection of immobilized agents will affect the immunohistochemical results of Rap1.
2., the expression of Rap1 and NF- kappa B increased significantly in MAA induced apoptotic spermatogenic cells, and all of them were nucleated and Co located. The results of immunoprecipitation indicated that there existed interaction between the two proteins, suggesting that Rap1 may interact with NF- kappa B to mediate apoptosis of spermatogenic cells.

【學位授予單位】：第四軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2012
【分類號】：R363

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本文編號：1742201