本文選題：小RNA3C蛋白酶 + 手足口病　； 參考：《北京協(xié)和醫(yī)學院》2011年博士論文

【摘要】：人腸道病毒71型(human enterovirus71, EV71)是1969年首次從加利福尼亞患有中樞神經系統(tǒng)疾病的嬰兒糞便標本中分離出來的。不同亞型感染后臨床癥狀不完全相同,通常導致手足口病(hand foot and mouth disease, HFMD).重癥手足口病可導致無菌性腦膜炎、腦干腦炎和脊髓灰質炎樣麻痹等多種與神經系統(tǒng)相關的疾病,致殘及病死率較高。自1974年首次報道以來,EV71已在世界范圍內引起十多次爆發(fā)與流行。在我國,手足口病曾經在南方許多省市發(fā)生過數(shù)次大規(guī)模流行,成為嚴重威脅人民健康的重大傳染病之一,目前尚無有效的藥物和疫苗。 我國研究人員病毒基因工程國家重點實驗室金奇教授等在1998年率先測定了EV71的基因全序列。EV71是小RNA病毒科,腸道病毒屬成員。病毒基因組為約7500個核苷酸的單股正鏈RNA,基因組中僅有一個開放閱讀框,編碼約2200個氨基酸的無生物活性的EV71多聚蛋白前體(polyprotein)。該多聚蛋白需進一步被剪切,產生成熟的病毒結構蛋白和非結構蛋白。這些過程主要依賴于EV713C蛋白酶。EV713C蛋白酶不但可以對病毒前體蛋白進行剪切,還可以降解宿主蛋白,如多聚腺嘌呤核苷酸修飾調控蛋白(cleavage stimulation factor-64, CstF-64),從而干擾宿主mRNA合成。最近的研究表明EV713C能夠通過結合視黃酸誘導基因-1(retinoid acid-inducible gene I, RIG-I)受體從而干擾RIG-I類解旋酶引發(fā)的天然免疫應答。除了蛋白酶功能以外,EV713C還具有識別病毒基因組RNA5'-非翻譯區(qū)(untranslated regions, UTR)的活性,暗示了EV713C可能參與病毒RNA基因組復制的過程�；贓V713C在病毒生命周期和病毒宿主相互作用過程中的重要功能,該蛋白被認為是抗病毒藥物設計的重要靶點之一。 由于EV713C蛋白酶尚無結構信息,極大地限制了結構導向性EV713C蛋白酶抑制劑的研究。本研究首次解析了高分辨率(1.0A)的EV713C蛋白及其與rupintrivir(AG7088,蘆平曲韋)形成復合物的晶體結構。結構分析表明,EV713C的基本結構與其它小RNA病毒3C蛋白酶相似,具有絲氨酸蛋白酶家族的典型折疊。我們發(fā)現(xiàn)：EV713C蛋白酶的β折疊環(huán)維持了罕見的開放構象,而這一重要的結構元件在其他結構已知的3C蛋白酶中維持閉合構象。通過結構比對分析,我們發(fā)現(xiàn)了兩個位于β折疊環(huán)底部的保守氨基酸Gly123和His133,可起到鉸鏈作用,從而控制β折疊環(huán)的構象變化。通過點突變實驗我們證明了兩個鉸鏈氨基酸肽鍵的靈活性在EV713C蛋白酶底物識別和底物水解中起到重要作用。Rupintrivir是通過模擬肽底物設計的一種抗人鼻病毒(human rhinovirus, HRV)3C蛋白酶的抑制劑,最近研究證明它也能有效抑制一些腸道病毒。我們發(fā)現(xiàn)rupintrivir可以有效抑制EV71病毒(BJ/CHN/2008)復制,并在體外抑制EV713C的蛋白酶活性。為了闡明rupintrivir抗EV71的分子機制,我們進行了EV713C蛋白酶/rupintrivir共結晶實驗獲得了高分辨率的復合物晶體結構。結構分析表明,rupintrivir不可逆的結合在EV713C蛋白酶底物識別口袋中,其結合模式大體類似于rupintrivir與HRV3C的相互作用。Rupintrivir的C端部分不能穩(wěn)定的結合在EV713C蛋白酶的離去集團口袋中。通過EV713C/rupintrivir復合物分子表面繪圖發(fā)現(xiàn)EV713C蛋白酶底物識別區(qū)中存在一個凹陷的S2’口袋。類似的結構特征不存在于HRV3C蛋白酶結構中,但是存在于柯薩奇病毒(coxsackievirus B, CVB)3C蛋白酶和脊髓灰質炎病毒(poliovirus, PV)3C蛋白酶結構中。結合點突變實驗我們證明了Glu71對于保持具有催化活性的His40的有效性構象具有不可替代的作用,從而進一步支持這類蛋白酶具有催化三聯(lián)體的蛋白酶水解機制的假說。我們的實驗數(shù)據(jù)還揭示了一個以往沒有描述過的保守氨基酸Arg39在EV713C蛋白酶催化過程中可起“中和凈帶電性”的作用,它通過減弱Glu71的靜負電性協(xié)助His40的去質子化過程。
[Abstract]:Human enteroviruses 71 ( EV71 ) are isolated from infant stool specimens of central nervous system disease in California for the first time in 1969 . The clinical symptoms of different subtypes are not identical , which usually lead to hand foot and mouth disease ( HFMD ) . Severe hand - foot - mouth disease can lead to aseptic meningitis , encephalitis of brain stem , poliomyelitis - like paralysis and other diseases related to nervous system , disability and mortality . Since the first report in 1974 , EV71 has caused more than ten outbreaks and epidemic in the world . In China , hand - foot - mouth disease has occurred several times in many provinces and cities of the South . It has become one of the major infectious diseases which seriously threaten the health of people . There are no effective drugs and vaccines at present .

In addition to the function of protease , EV713C has an open reading frame for interfering host mRNA synthesis . In addition to the function of protease , EV713C can also degrade host protein , such as poly - adenine nucleotide modified regulatory protein ( CstF - 64 ) , and thus interfere with host mRNA synthesis .

In order to clarify the molecular mechanism of EV713C protease , we found two conserved amino acids Gly123 and His133 in the base of EV713C protease .

【學位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學院
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2011
【分類號】：R373.25;Q55

【參考文獻】

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1 林馨;韓關根;;腸道病毒71型分子生物學研究[J];浙江中醫(yī)藥大學學報;2008年03期

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本文編號：1740374