發(fā)布時間：2018-04-12 13:57

  本文選題：乙酰肝素酶 + 原核表達(dá)�。� 參考：《廣東藥學(xué)院》2012年碩士論文

【摘要】：目的：雖然已經(jīng)明確了HPSE在腫瘤轉(zhuǎn)移中的相關(guān)作用，但還有很多方面有待研究，為了研究HPSE在腫瘤發(fā)生、腫瘤浸潤、轉(zhuǎn)移及血管生成中所起的作用，獲得大量的HPSE以及其抗體，就顯得很有必要。本研究利用原核表達(dá)系統(tǒng)獲得相關(guān)HPSE抗原，成功得到以包涵體形式表達(dá)的人全長HPSE蛋白，并運(yùn)用雜交瘤技術(shù)獲得抗HPSE的單克隆抗體。 方法：依據(jù)NCBI上公布的人HPSE cDNA序列，設(shè)計(jì)可以克隆HPSE全長片段的引物，選擇NcoⅠ和XhoⅠ作為酶切位點(diǎn)，將HPSE全長基因片段連接到pET28a(+)質(zhì)粒上，在大腸桿菌中表達(dá)HPSE蛋白；探索不同誘導(dǎo)時間、不同濃度的誘導(dǎo)劑IPTG以及所用的培養(yǎng)基對重組人HPSE蛋白表達(dá)的影響；運(yùn)用HisTrap TMcrude柱得到純度較高的重組人HPSE蛋白。 本室自制的重組人HPSE50kDa蛋白免疫BALB/c小鼠，通過雜交瘤技術(shù)將SP2/0與免疫B淋巴細(xì)胞融合，間接ELISA檢測抗體分泌情況，ELISA所用的抗原為重組人HPSE全長蛋白、重組人HPSE50kDa蛋白以及人HPSE多肽Lys158-Cys172，該多肽包含底物肝素與HPSE結(jié)合的特定序列，即HPSE的活性位點(diǎn)。陽性克隆進(jìn)行多次篩選以及亞克隆，得到抗HPSE的單克隆抗體。Western blot檢測所制備的抗原與抗體結(jié)合的特異性。 結(jié)果：成功在大腸桿菌中表達(dá)出重組人HPSE全長蛋白，并得到其最佳表達(dá)條件為：IPTG濃度為1mmol/L，誘導(dǎo)時間為5h，在2×YT培養(yǎng)基中誘導(dǎo)時目的蛋白表達(dá)量最高。成功的篩選出兩株特異性較好抗HPSE的單克隆抗體，4D12、3F5效價均大于1:1.28×105，其親和力常數(shù)分別為2.71×109M-1、6.67×108M-1，4D12與50kDa HPSE、人全長HPSE反應(yīng)，3F5與50kDa HPSE、人全長HPSE以及HPSE50kDa N端的Lys158-Cys172多肽反應(yīng)。 結(jié)論：成功構(gòu)建了人HPSE原核表達(dá)系統(tǒng)，，并篩選出兩株特異性好抗HPSE的單克隆抗體。
[Abstract]:Objective: although the role of HPSE in tumor metastasis has been clarified, there are still many aspects to be studied. In order to study the role of HPSE in tumorigenesis, tumor invasion, metastasis and angiogenesis, a large number of HPSE and its antibodies were obtained.It is necessary.In this study, HPSE antigens were obtained by using prokaryotic expression system, and human full-length HPSE proteins expressed in inclusion bodies were successfully obtained, and monoclonal antibodies against HPSE were obtained by hybridoma technique.Methods: according to the human HPSE cDNA sequence published on NCBI, primers were designed to clone the full-length HPSE fragment. Nco 鈪

本文編號：1740031