發(fā)布時(shí)間：2018-04-11 04:01

  本文選題：酸性成纖維細(xì)胞生長因子 + 穿膜肽　； 參考：《吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)》2011年碩士論文

【摘要】：酸性成纖維細(xì)胞生長因子(acidic fibroblast growth factor, aFGF)是FGF家族的一員,具有廣泛的生理藥理作用,在組織和器官發(fā)育、血管發(fā)生、細(xì)胞的分化與凋亡、腫瘤發(fā)生和傷口愈合等方面發(fā)揮重要作用。然而aFGF作為生物大分子進(jìn)入細(xì)胞發(fā)揮作用是通過激活其受體實(shí)現(xiàn)的,在沒有受體存在的情況下,進(jìn)入細(xì)胞發(fā)揮作用成了不可忽略的難題。因此將aFGF與穿膜肽(transcriptional activator protein, Tat)融合表達(dá)并使其進(jìn)入細(xì)胞發(fā)揮作用具有一定的意義。本研究擬利用基因工程技術(shù)將aFGF_(19-154)-Tat與表達(dá)載體相連接后導(dǎo)入到適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞中,使其高效表達(dá)aFGF_(19-154)-Tat融合蛋白,分離純化獲得具有促細(xì)胞增殖活性的融合蛋白,為進(jìn)一步開發(fā)基因工程藥物奠定基礎(chǔ)。 目的：以大腸桿菌為宿主菌,利用基因工程技術(shù)表達(dá)重組人酸性成纖維細(xì)胞生長因子(aFGF)-穿膜肽(Tat)融合蛋白,建立aFGF_(19-154)-Tat中試規(guī)模的發(fā)酵、純化工藝以及體外生物學(xué)活性測(cè)定方法,為進(jìn)一步開發(fā)aFGF_(19-154)-Tat融合多肽創(chuàng)新藥物奠定基礎(chǔ),并為相關(guān)基因工程藥物提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法：從人胚胎肺成纖維細(xì)胞中提取總RNA,通過RT-PCR方法獲得aFGF的cDNA,并以aFGF的cDNA為模板,使用含有Tat片段的引物擴(kuò)增出aFGF_(19-154)-Tat目的基因。將aFGF_(19-154)-Tat片段連接到原核表達(dá)載體pET3c中,構(gòu)建重組原核表達(dá)質(zhì)粒pET3c-aFGF_(19-154)-Tat,表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)宿主菌中,IPTG誘導(dǎo)表達(dá),篩選高效表達(dá)的工程菌。工程菌的搖瓶發(fā)酵和發(fā)酵罐高密度發(fā)酵,通過陽離子交換(CM-Sepharose FF)層析、肝素親和層析(Heparin-Sepharose CL-6B)和凝膠排阻層析(Sephadex G-50)方法分離純化目的蛋白aFGF_(19-154)-Tat。Western blotting和高效液相色譜分析純化的aFGF-Tat融合蛋白,MTT法體外檢測(cè)aFGF-Tat融合蛋白對(duì)NIH 3T3細(xì)胞的促增殖作用。 結(jié)果:DNA測(cè)序結(jié)果證實(shí)成功構(gòu)建pET3c-aFGF_(19-154)-Tat重組質(zhì)粒,并在大腸桿菌BL21(DE3)中高效表達(dá)aFGF_(19-154)-Tat融合蛋白。優(yōu)化表達(dá)條件：37℃條件下培養(yǎng),當(dāng)A600為08時(shí)加入終濃度為0.8mmM的IPTG誘導(dǎo)4h,表達(dá)量達(dá)15%以上。高密度發(fā)酵結(jié)果顯示,每升發(fā)酵液可獲得菌體90g。菌體超聲破碎,經(jīng)SDS-PAGE證實(shí)其相對(duì)分子質(zhì)量與理論預(yù)期值相符,并且是可溶性表達(dá),通過陽離子交換層析、肝素親和層析和凝膠排阻層析純化,獲得aFGF_(19-154)-Tat融合蛋白,高效液相色譜分析顯示融合蛋白純度高于95%。Western blotting分析表明表達(dá)產(chǎn)物與人aFGF多克隆抗體具有特異結(jié)合能力。MTT法體外檢測(cè)證實(shí)融合蛋白具有促進(jìn)NIH 3T3細(xì)胞增殖作用,這與陽性對(duì)照組aFGF的生物學(xué)活性基本相同并顯著高于空白對(duì)照組(P0.01)。 結(jié)論：成功構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒pET3c-aFGF_(19-154)-Tat,并得到重組人aFGF_(19-154)-Tat融合蛋白工程菌,發(fā)酵純化獲得aFGF_(19-154)-Tat融合蛋白,體外試驗(yàn)證實(shí)了aFGF1g-154-Tat融合蛋白具有促細(xì)胞增殖活性,這對(duì)日后研究治療損傷修復(fù)類藥物提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號(hào)】：R346

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1734314