本文選題：微流控芯片 + 秀麗隱桿線蟲��；參考：《華中科技大學(xué)》2011年博士論文

【摘要】：秀麗隱桿線蟲是一種經(jīng)典的研究發(fā)育生物學(xué)、遺傳學(xué)和基因組學(xué)的重要模式動物。由于它僅由302個神經(jīng)元分工操縱著基本的行為,使其迅速成為理想的用于研究行為與神經(jīng)活動之間聯(lián)系的動物模型。但由于它個體很小(體長1毫米),且活體的線蟲時刻不停的擺動,科學(xué)家們難于用常規(guī)的宏觀方法將其固定于顯微鏡視場內(nèi)進(jìn)行解剖學(xué)分析、微手術(shù)操作、神經(jīng)元熒光成像以及給予微環(huán)境局部刺激等研究。傳統(tǒng)的方法通常使用粘合劑將線蟲粘在瓊脂糖平板上,或用麻醉藥物麻醉使它保持不動,或使用微吸管吸住頭或尾固定住部分的身體等。但是這些方法都存在著耗時、通量低、有損有毒的缺點(diǎn)。如何快速、高通量、無損無毒地固定活體線蟲,以進(jìn)行高分辨率的體內(nèi)神經(jīng)元成像研究是一個迫待需要解決的問題。 微流控芯片的出現(xiàn)為固定活體線蟲提供了良好的契機(jī)。芯片通道與線蟲尺寸的完美匹配以及材料的無毒性、透明、易加工等優(yōu)勢使得它迅速成為線蟲研究方法領(lǐng)域中一個快速發(fā)展的方向。經(jīng)過近幾年科學(xué)家們不斷的嘗試,雙層膜閥和負(fù)壓側(cè)吸相結(jié)合的方法能夠很好的固定線蟲的身體用于飛秒激光燒蝕和雙光子成像研究。但由于這種方法的種種限制,使它僅適用于全身的固定而無法暴露出局部比如頭部。而局部的刺激對于研究線蟲在應(yīng)答外圍環(huán)境變化時單獨(dú)的某個神經(jīng)元的特異性反應(yīng)十分重要,很大程度上排除了神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)中其它神經(jīng)元的干擾因素,使生物問題的分析變得簡單。也有研究者嘗試使用低矮的錐形通道來匹配線蟲錐形的頭部形狀和尺寸,通過擠壓頭部使神經(jīng)元保持在成像焦平面上,但也同時引入了卸載困難,通量低的問題。 本文采用一種新型的PDMS梳狀微氣動閥,通過可控的氣動方式使膜向下彎曲或恢復(fù),高通量的固定下層通道中流過的線蟲。具有五個固定點(diǎn)的梳妝閥比傳統(tǒng)的塊閥捕獲成功率更高、固定效果更好,更重要的是它允許頭部感受器末端暴露于閥外,配合各種用于局部藥物活體刺激觀察實驗。另外,由于它可以直接匹配下層方形直通道使用,可廣泛的應(yīng)用于各種高通量的基于活體線蟲固定前提的實驗,諸如高通量熒光株系篩選、藥物或突變體篩選、神經(jīng)燒蝕、微注射等。在固定效果方面,通過與膠水固定法比較,本方法能夠長期使神經(jīng)元處于穩(wěn)定不動的狀態(tài),達(dá)到與膠水一致的固定效果；并且經(jīng)過芯片內(nèi)長時間的固定后仍能保持良好的活性,身體擺動頻率、繁殖產(chǎn)卵數(shù)目、生命周期等生命體征與未經(jīng)過芯片固定的線蟲保持良好的一致性。說明PDMS梳狀微氣動閥是一種高效、無損、穩(wěn)定的新型固定方法。 在穩(wěn)定固定的基礎(chǔ)上,我們搭建了自動進(jìn)樣平臺,為進(jìn)一步的成像實驗大大地提高了效率。為研究線蟲在液態(tài)藥物環(huán)境下的神經(jīng)元應(yīng)答,我們利用雙相或多相層流的方式輸出切換快速靈敏的藥液刺激,改變已固定線蟲的頭部周圍微環(huán)境,記錄線蟲ASH神經(jīng)元在不同藥物、濃度、時長以及單藥重復(fù)刺激和多路藥物切換刺激等情況下的不同反應(yīng),并通過野生型與突變型線蟲株系的神經(jīng)元鈣信號差異直觀而快速的體現(xiàn)突變體的功能缺失。該芯片可廣泛應(yīng)用于高通量突變體篩選或藥物篩選、神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)與不同行為模式之間的聯(lián)系等方面。為研究線蟲在氣態(tài)藥物環(huán)境下的神經(jīng)元應(yīng)答,我們利用層流的方式輸出靈敏的氣味刺激,改變已固定線蟲的頭部微環(huán)境,首先記錄到線蟲URX/BAG神經(jīng)元在不同濃度氧氣水平的反應(yīng),其后觀察到ASH神經(jīng)元在低濃度氣態(tài)辛醇刺激時的應(yīng)答。該方法首次實現(xiàn)了氣體精確局部刺激線蟲,為簡化和更準(zhǔn)確研究氣體感受神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)提供了新思路。 同時,我們也建立了簡單的行為芯片模型來研究線蟲對氣味、光、電、溫度的趨向性以及對機(jī)械刺激的反應(yīng),從行為水平理解線蟲神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的各種功能,為后續(xù)研究奠定了基礎(chǔ)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號】：R383.1

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