本文選題：流感病毒　切入點(diǎn)：犬RNA多聚酶I　出處：《吉林大學(xué)》2012年碩士論文

【摘要】：流感病毒屬于正黏病毒家族（Orthomyxoviridae），按照其NP和M蛋白的抗原性不同，可以將其分為A、B和C三個(gè)血清型，所有動(dòng)物流感病毒都屬于A型。依據(jù)流感病毒表面糖蛋白血凝素（HA）和神經(jīng)氨酸酶（NA）的抗原性差異，又可將A型流感病毒分為16個(gè)HA亞型和9個(gè)NA亞型。在水禽中可以分離到A型流感病毒的所有亞型。從人和多種動(dòng)物（如豬、馬、海洋哺乳動(dòng)物、貓、犬和禽類）體內(nèi)已經(jīng)分離到多株A型流感病毒。在過(guò)去十年，高致病性禽流感H5N1和甲型流感H1N1已經(jīng)向全世界展示流感病毒在人與動(dòng)物之間的快速擴(kuò)散和傳播能力。H3N8亞型流感病毒主要引起馬的呼吸系統(tǒng)感染，，但在2004年的美國(guó)，馬源H3N8亞型流感病毒已經(jīng)擴(kuò)散到犬，引起犬呼吸道疾病的廣泛流行。 利用反向遺傳系統(tǒng)拯救A型流感病毒對(duì)于流感病毒致病機(jī)理研究以及疫苗開(kāi)發(fā)均具有重要意義。通過(guò)將流感病毒基因組8個(gè)片段克隆到人的RNA多聚酶I啟動(dòng)子下游構(gòu)建能夠轉(zhuǎn)錄病毒基因組的8個(gè)重組質(zhì)粒，再將其與編碼NP和三個(gè)多聚酶基因表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染適宜細(xì)胞系即可拯救出具有感染性的流感病毒顆粒。后來(lái)，Hoffman等對(duì)這一反向遺傳系統(tǒng)進(jìn)行了改進(jìn)，目前的拯救系統(tǒng)只需8個(gè)基于pol I/II的雙向表達(dá)質(zhì)粒而不是原來(lái)的12個(gè)質(zhì)粒即可完成病毒拯救。然而，目前的拯救系統(tǒng)存在一個(gè)缺陷，那就是它是基于人的pol I啟動(dòng)子，病毒拯救只能在人和靈長(zhǎng)類細(xì)胞上完成，對(duì)其它種屬的細(xì)胞系，如MDCK并不支持。 為了開(kāi)發(fā)能夠在MDCK細(xì)胞上直接拯救流感病毒的反向遺傳系統(tǒng)，本研究從MDCK細(xì)胞基因組中擴(kuò)增了犬的pol I啟動(dòng)子。PCR產(chǎn)物克隆到pTA2載體后測(cè)序，序列經(jīng)BLAST比對(duì)，與已知的犬RNA多聚酶I啟動(dòng)子區(qū)同源性達(dá)93%。接下來(lái)，我們構(gòu)建了基于犬pol I啟動(dòng)子的雙向轉(zhuǎn)錄表達(dá)載體pVW3000，這一載體系統(tǒng)支持以同一個(gè)模板同時(shí)轉(zhuǎn)錄病毒基因組RNA和mRNA。首先，通過(guò)重疊PCR方法將犬pol I啟動(dòng)子、兩個(gè)并列的BsmB I位點(diǎn)和33nt的鼠pol I終止子序列進(jìn)行拼接。而后，約300bp的犬pol I啟動(dòng)子表達(dá)盒被反向插入到pVAX1載體CMV啟動(dòng)子和poly（A）之間的BamHI/EcoR I位點(diǎn)。最后，雙向轉(zhuǎn)錄表達(dá)載體pVW3000經(jīng)酶切和測(cè)序鑒定均正確。 為了鑒定本研究所克隆的犬pol I啟動(dòng)子在MDCK細(xì)胞上的轉(zhuǎn)錄效率，我們還構(gòu)建了熒光報(bào)告質(zhì)粒pVW-M-GFP。簡(jiǎn)言之，將含流感病毒M蛋白非編碼區(qū)側(cè)翼序列的增強(qiáng)型綠色熒光蛋白基因克隆至pVW3000的BsmB I位點(diǎn)，重組質(zhì)粒經(jīng)酶切和測(cè)序均正確。接下來(lái)，我們利用A型流感病毒通用引物RT-PCR方法克隆了H3N8亞型流感病毒全基因組8個(gè)片段，并將其克隆至自行構(gòu)建的雙向轉(zhuǎn)錄表達(dá)載體pVW3000，成功獲得7個(gè)重組質(zhì)粒pVW3000-PB1, pVW3000-PA, pVW3000-HA, pVW3000-NA,pVW3000-NP, pVW3000-M和pVW3000-NS，重組質(zhì)粒經(jīng)酶切和測(cè)序鑒定均正確。這些研究為在MDCK細(xì)胞上直接拯救A型流感病毒以及進(jìn)一步研究病毒致病機(jī)制和實(shí)現(xiàn)疫苗的快速制備奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。
[Abstract]:Influenza virus belongs to Orthomyxoviridaeae family. According to the antigenicity of NP and M proteins, influenza virus can be divided into three serotypes: Agna B and C, and all animal influenza viruses belong to type A.According to the antigenicity of influenza virus surface glycoprotein hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NAA), influenza A virus can be divided into 16 HA subtypes and 9 na subtypes.All subtypes of influenza A virus can be isolated from waterfowl.A number of influenza A viruses have been isolated from humans and various animals, such as pigs, horses, marine mammals, cats, dogs and birds.In the past decade, highly pathogenic avian influenza H5N1 and influenza A H1N1 have demonstrated to the world the rapid spread and transmission of influenza viruses between humans and animals. H3N8 subtype influenza viruses mainly cause respiratory infections in horses, but in the United States in 2004,Equine H3N8 subtype influenza virus has spread to dogs, causing widespread prevalence of respiratory diseases in dogs.Rescuing influenza A virus by reverse genetic system is of great significance for the study of the pathogenic mechanism of influenza virus and the development of vaccine.Eight recombinant plasmids capable of transcription of influenza virus genome were constructed by cloning 8 fragments of influenza virus genome into human RNA polymerase I promoter downstream.The influenza virus particles could be saved by co-transfection with NP and three plasmids encoding polymerase gene into suitable cell lines.The reverse genetic system was improved by Hoffman et al. The current rescue system only needs 8 bidirectional expression plasmids based on pol I/II instead of 12 original plasmids to complete virus rescue.However, the current rescue system has a defect, that is, it is based on human pol I promoter, virus rescue can only be done on human and primate cells, and it does not support other cell lines, such as MDCK.In order to develop a reverse genetic system capable of directly saving influenza virus from MDCK cells, the dog pol I promoter. PCR product was amplified from the genome of MDCK cells and cloned into pTA2 vector. The sequence was sequenced by BLAST alignment.The homology was 933 with the known promoter of RNA polymerase I in dogs.Next, we constructed a bidirectional transcriptional expression vector pVW3000based on canine pol I promoter, which supports the simultaneous transcription of virus genomic RNA and mRNA with the same template.Firstly, the dog pol I promoter, two parallel BsmB I loci and the 33nt pol I Terminator sequence were spliced by overlapping PCR method.Then, about 300bp's canine pol I promoter cassette was inserted into the BamHI/EcoR I site between the pVAX1 vector CMV promoter and Poly A.Finally, the bidirectional transcriptional expression vector pVW3000 was confirmed by restriction endonuclease digestion and sequencing.In order to identify the transcriptional efficiency of the cloned canine pol I promoter in MDCK cells, we also constructed the fluorescent reporter plasmid pVW-M-GFP.In short, the enhanced green fluorescent protein gene containing the flanking region of M protein of influenza virus was cloned to the BsmB I site of pVW3000, and the recombinant plasmid was digested and sequenced correctly.Next, we cloned the whole genome of H3N8 subtype influenza virus by using the universal primer RT-PCR method of influenza A virus.Seven recombinant plasmids pVW3000-PB1, pVW3000-PA, pVW3000-HA, pVW3000-NAVW3000-NPN, pVW3000-M and pVW3000-NSN were successfully cloned into the self-constructed bidirectional transcriptional expression vector pVW3000. the recombinant plasmids were confirmed by restriction endonuclease digestion and sequencing.These studies have laid a solid foundation for the direct rescue of influenza A virus in MDCK cells and the further study of the pathogenic mechanism of the virus and the rapid preparation of vaccine.
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號(hào)】：R373

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 劉玉良,劉秀梵;RNA病毒“拯救”技術(shù)[J];中國(guó)生物工程雜志;2003年09期

2 劉玉良,劉秀梵;RNA病毒反向遺傳操作技術(shù)研究進(jìn)展[J];病毒學(xué)報(bào);2004年01期

3 黃耀偉,李龍,于漣;人類及動(dòng)物RNA病毒的反向遺傳系統(tǒng)[J];生物工程學(xué)報(bào);2004年03期

4 胡孔新,于建石,孫玉蘭,孟祥芝,王曉芳,張全福,李川,梁米芳,李德新;麻疹病毒全長(zhǎng)cDNA構(gòu)建及其感染性的研究[J];病毒學(xué)報(bào);2004年03期

5 盧建紅,龍進(jìn)學(xué),邵衛(wèi)星,韋棟平,劉秀梵,張艷梅;用反向遺傳操作技術(shù)產(chǎn)生致弱的H5亞型重組流感病毒[J];微生物學(xué)報(bào);2005年01期

6 李龍;魏永偉;黃耀偉;于漣;;傳染性法氏囊病毒HZ2株VP5基因缺失株的構(gòu)建[J];科學(xué)通報(bào);2006年14期

7 修梅紅;王芹;唐麗華;曹守春;李偉紅;韋燕;陸鵬;梁米芳;李德新;;用表達(dá)T7RNA聚合酶細(xì)胞系拯救麻疹病毒微復(fù)制子[J];病毒學(xué)報(bào);2007年04期

8 房師松;董捷;程小雯;呂星;何建凡;逯建華;舒躍龍;;帶TAP標(biāo)簽的流感病毒8質(zhì)粒反向遺傳包裝系統(tǒng)的初步構(gòu)建[J];中國(guó)熱帶醫(yī)學(xué);2008年06期

9 房紅瑩;羅滿林;;豬傳染性胃腸炎病毒反向遺傳研究進(jìn)展[J];畜牧與獸醫(yī);2008年04期

10 唐應(yīng)華;吳培培;孫慶;彭大新;張文俊;李彥芳;汪文斌;龍進(jìn)學(xué);張?jiān)u滸;劉秀梵;;HA基因322位和329位氨基酸對(duì)H5N1亞型禽流感病毒毒力的影響[J];病毒學(xué)報(bào);2008年05期

相關(guān)會(huì)議論文 前10條

1 祁小樂(lè);秦立廷;王永強(qiáng);高立;于飛;高玉龍;高宏雷;王笑梅;;雞傳染性法氏囊病病毒反向遺傳研究和新型疫苗研制[A];中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)禽病學(xué)分會(huì)第十五次學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2010年

2 王力華;;狂犬病毒反向遺傳系統(tǒng)的建立及應(yīng)用[A];2010全國(guó)狂犬病防控高層論壇論文集[C];2010年

3 孫玉章;丁壯;孟柯音;叢彥龍;母連志;王昌慶;李少麗;;鵝源副黏病毒NA-1株反向遺傳操作體系的建立[A];中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)2009學(xué)術(shù)年會(huì)論文集（下冊(cè)）[C];2009年

4 劉玲玲;龔鍇;明平剛;黃瑩;唐青;公衍道;;利用狂犬病病毒反向遺傳系統(tǒng)表達(dá)鐵蛋白的初步研究[A];第十一次中國(guó)生物物理學(xué)術(shù)大會(huì)暨第九屆全國(guó)會(huì)員代表大會(huì)摘要集[C];2009年

5 劉曉慧;孫招金;陳晶;艾軍;薛素強(qiáng);孫京臣;郭霄峰;;狂犬病毒Hep-dG株的拯救及其生物學(xué)特性的研究[A];首屆中國(guó)獸藥大會(huì)——獸醫(yī)生物制品學(xué)、獸醫(yī)微生物學(xué)學(xué)術(shù)論壇論文集（2008）[C];2008年

6 牛學(xué)鋒;劉曉慧;孫招金;陳晶;江飆;施赫赫;孫京臣;郭霄峰;;表達(dá)犬細(xì)小病毒VP2基因的重組狂犬病毒生物學(xué)特性的研究[A];首屆中國(guó)獸藥大會(huì)——獸醫(yī)生物制品學(xué)、獸醫(yī)微生物學(xué)學(xué)術(shù)論壇論文集（2008）[C];2008年

7 孫玉章;丁壯;孟柯音;叢彥龍;母連志;王昌慶;李少麗;;鵝源副黏病毒NA-1株反向遺傳操作體系的建立[A];中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)家畜傳染病學(xué)分會(huì)第七屆全國(guó)會(huì)員代表大會(huì)暨第十三次學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集（下冊(cè)）[C];2009年

8 劉曉慧;孫招金;陳晶;艾軍;孫京臣;郭霄峰;;狂犬病毒Hep-dG株的拯救及其生物學(xué)特性的研究[A];第二屆全國(guó)人畜共患病學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2008年

9 彭亞平;周紅波;陳煥春;金梅林;;“禽-豬”流感重配病毒的拯救及其生物學(xué)特性的研究[A];中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)禽病學(xué)分會(huì)第十四次學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2008年

10 劉曉慧;艾軍;孫招金;陳晶;孫京臣;郭霄峰;;狂犬病毒Hep-Flury-dG株的拯救及其生物學(xué)特性的研究[A];中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)獸醫(yī)公共衛(wèi)生學(xué)分會(huì)成立大會(huì)暨第一次學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2008年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 盧建紅;H9N2亞型AIV基因組序列分析及用反向遺傳技術(shù)產(chǎn)生多個(gè)H9N2和H5重組流感病毒[D];揚(yáng)州大學(xué);2004年

2 李龍;傳染性法氏囊病病毒VP5缺失減毒株的構(gòu)建[D];浙江大學(xué);2006年

3 孫兆增;水皰性口炎病毒反向遺傳重組載體的構(gòu)建[D];吉林大學(xué);2006年

4 王革非;流感病毒誘導(dǎo)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的病理變化及天然免疫反應(yīng)[D];汕頭大學(xué);2008年

5 崔淑娟;甲型流感病毒亞型間血清學(xué)交叉反應(yīng)特征研究及反向遺傳系統(tǒng)的優(yōu)化[D];北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院;2009年

6 于海;中國(guó)部分地區(qū)豬流感病毒的分子流行病學(xué)研究[D];中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2008年

7 仇旭升;反向遺傳技術(shù)研究新城疫病毒P基因功能及其對(duì)病毒毒力的影響[D];揚(yáng)州大學(xué);2009年

8 潘鐵驪;狂犬病病毒BD06株生物學(xué)特性鑒定及反向遺傳系統(tǒng)的建立[D];中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院;2011年

9 李洪海;應(yīng)用RNAi技術(shù)對(duì)肝癌癌基因p28～(GANK)生物學(xué)功能的研究[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2004年

10 張淼濤;豬瘟病毒C-株全長(zhǎng)cDNA感染性的恢復(fù)及其標(biāo)記疫苗的構(gòu)建[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2005年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 湯晶;犬poll啟動(dòng)子雙向轉(zhuǎn)錄表達(dá)載體的構(gòu)建及流感病毒基因組克隆[D];吉林大學(xué);2012年

2 師新川;牛副流感病毒3型NM09株反向遺傳系統(tǒng)的建立[D];中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2012年

3 李燕華;豬繁殖與呼吸綜合征病毒主要糖蛋白GP5的反向遺傳研究[D];中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2010年

4 許江濤;傳染性法氏囊病病毒反向遺傳系統(tǒng)及RT-LAMP診斷方法的建立[D];青島農(nóng)業(yè)大學(xué);2010年

5 劉志軍;應(yīng)用12質(zhì)粒轉(zhuǎn)染系統(tǒng)構(gòu)建A/HNP/03（H_9N_2）重組禽流感病毒[D];河南農(nóng)業(yè)大學(xué);2004年

6 索永兵;H5N1亞型禽流感病毒DKFJ/01/02株分子生物學(xué)特性研究及反向遺傳操作系統(tǒng)的建立[D];內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué);2008年

7 白萱;反向遺傳構(gòu)建A組輪狀病毒重配毒株的研究[D];華中師范大學(xué);2008年

8 丁玉林;異源強(qiáng)毒株HN基因替換對(duì)嵌合體新城疫rLaSota病毒致病力影響的研究[D];內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué);2008年

9 龍川;重配H8N4亞型禽流感病毒的拯救[D];吉林農(nóng)業(yè)大學(xué);2011年

10 桑曉宇;H9N2亞型禽流感病毒在豚鼠間水平傳播能力研究及其反向遺傳系統(tǒng)構(gòu)建[D];中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2012年

本文編號(hào)：1720522