本文選題：可溶性DC-SIGN　切入點(diǎn)：夾心ELISA　出處：《南方醫(yī)科大學(xué)》2011年碩士論文

【摘要】：二十幾年前,天然免疫還被認(rèn)為是一個(gè)退化的免疫機(jī)制,極少受到免疫學(xué)家的關(guān)注,而獲得性免疫憑借其高特異性的抗原識(shí)別系統(tǒng)及復(fù)雜的分子與細(xì)胞間相互作用受到大家的追捧。近十幾年來(lái),天然免疫越來(lái)越受到人們的青睞。天然免疫系統(tǒng)是由多種識(shí)別及效應(yīng)分子組成的復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu),它們協(xié)同作用,構(gòu)成機(jī)體抗感染的第一道防線；并感受危險(xiǎn)信號(hào),指導(dǎo)獲得性免疫應(yīng)答的性質(zhì)和強(qiáng)度。作為機(jī)體免疫防御的第一道防線,天然免疫遠(yuǎn)比我們先前認(rèn)為的更重要、更復(fù)雜、更具泛特異性而致其識(shí)別譜更廣；越來(lái)越多的證據(jù)表明天然免疫對(duì)于獲得性免疫應(yīng)答具有重要的指導(dǎo)作用。 在這個(gè)重要的防御系統(tǒng)中,凝集素家族分子扮演著不可或缺的角色。樹(shù)突狀細(xì)胞特異性的結(jié)合細(xì)胞間黏附分子3的非整合素(dendritic cell-specific intercellular adhesion molecule 3-grabbing nonintegrin, DC-SIGN, CD209)屬于C型凝集素超家族成員,是一種Ⅱ型跨膜蛋白,分子量為44KD,由404個(gè)氨基酸組成。從C端至N端依次為糖識(shí)別域(carbohydrate recognition domain, CRD)、頸區(qū)、跨膜區(qū)和胞漿區(qū)。DC-SIGN選擇性表達(dá)于樹(shù)突狀細(xì)胞(dendritic cell, DC)、巨噬細(xì)胞及激活后的B細(xì)胞,多種組織如滑液、胎盤(pán)、淋巴組織、皮肽真皮層、宮頸上皮下區(qū)已檢測(cè)出DC-SIGN。DC-SIGN屬于凝集素超家族中C型凝集素家族的成員,其CRD可以鈣離子依賴的方式特異性結(jié)合多種病原體糖類(lèi)抗原,包括甘露聚糖、巖藻糖等。DC-SIGN之所以被人們重視,是由于其作為膜受體,介導(dǎo)了DC對(duì)抗原的攝取、與內(nèi)皮表面黏附、遷移與成熟,并與初始T細(xì)胞粘附,在觸發(fā)T細(xì)胞應(yīng)答中發(fā)揮著重要作用。此外,DC-SIGN還參與多種病原體如HIV、HCV及結(jié)核分枝桿菌感染細(xì)胞及其在細(xì)胞間的傳播。近年來(lái),本課題組一直在研究甘露聚糖結(jié)合凝集素(mannan-binding lectin, MBL)的免疫調(diào)節(jié)作用,但它是一個(gè)存在于血清中的可溶性模式識(shí)別受體。DC-SIGN與MBL同屬于C型凝集素家族。那么,DC-SIGN是否存在可溶性形式即sDC-SIGN,其是否也能直接調(diào)節(jié)獲得性免疫應(yīng)答呢? 本研究中,我們?cè)吮磉_(dá)了sDC-SIGN,建立了sDC-SIGN雙夾心ELISA檢測(cè)體系,收集血漿樣品,并對(duì)收集到的血漿樣品進(jìn)行檢測(cè),初步證實(shí)在人體血漿中確實(shí)存在sDC-SIGN。進(jìn)一步,我們從細(xì)胞增殖,細(xì)胞因子分泌及細(xì)胞活化三個(gè)層面研究了sDC-SIGN對(duì)T細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)功能的影響。 一、sDC-SIGN雙夾心ELISA檢測(cè)體系的建立及血漿樣本的檢測(cè) 前期本科室已經(jīng)制備出抗sDC-SIGN兩株單抗1C6和4H3,進(jìn)一步我們分別通過(guò)ELSIA. WesternBlot同商品化的anti-CD209(anti-DCSIGN)做了比較,鑒定兩株單抗的敏感性與特異性。我們?cè)吮磉_(dá)的sDC-SIGN由糖識(shí)別域即CRD區(qū)和頸區(qū)兩部分組成,在糖結(jié)合實(shí)驗(yàn)中1C6與sDC-SIGN的結(jié)合力明顯大于4H3,據(jù)此推測(cè)4H3識(shí)別的位點(diǎn)很靠近CRD區(qū)。為了得到靈敏度較高的ELISA檢測(cè)體系,我們分別將兩株單抗進(jìn)行生物素標(biāo)記,通過(guò)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件,最后確定以單抗1C6為捕獲抗體,即包被抗體,以標(biāo)記生物素的4H3為檢測(cè)抗體,并進(jìn)行了最佳工作濃度,反應(yīng)時(shí)間及溫度的選擇與確定。接下來(lái),我們收集到219例普通人群血漿樣本,106例內(nèi)分泌失調(diào)人群血漿樣本進(jìn)行檢測(cè)。根據(jù)檢測(cè)結(jié)果分析,人體中確實(shí)有sDC-SIGN的存在。進(jìn)一步,我們對(duì)sDC-SIGN的免疫調(diào)節(jié)用進(jìn)行了研究。 二、sDC-SIGN對(duì)T細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)功能的研究 研究發(fā)現(xiàn),與DC-SIGN同屬于C型凝集素超家族的成員SP-A,SP-D對(duì)天然免疫和獲得性免疫發(fā)揮調(diào)節(jié)功能。研究表明, SP-A,SP-D能以IL-2依賴及IL-2非依賴兩種方式,抑制T細(xì)胞的增殖,調(diào)節(jié)T細(xì)胞免疫應(yīng)答。前期實(shí)驗(yàn)我們已經(jīng)檢測(cè)到人體血漿中存在sDC-SIGN,存在即有意義!!目前很少有DC-SIGN免疫調(diào)節(jié)作用的有關(guān)報(bào)道,其對(duì)T淋巴細(xì)胞直接調(diào)節(jié)作用的報(bào)道更是從未問(wèn)聞。根據(jù)膠凝素家族各成員之間的結(jié)構(gòu)和功能同源性,我們推測(cè)sDC-SIGN很可能對(duì)獲得性免疫也有影響。 基于本室的前期工作sDC-SIGN原核表達(dá)載體的構(gòu)建,我們首先原核表達(dá)了sDC-SIGN蛋白,然后采用密度梯度離心法自成年健康志愿者外周血分離單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cells, PBMC),并采用MACS負(fù)選法純化CD3+T淋巴細(xì)胞。分別用非特異性刺激劑刀豆蛋白A(ConA)和特異性刺激劑anti-CD3/CD28單抗活化CD3+T淋巴細(xì)胞,收集培養(yǎng)上清,進(jìn)行細(xì)胞因子IL-2, IFN-γ, IL-10, IL-6及IL-17a的檢測(cè)。另外采用CFSE法,分析sDC-SIGN對(duì)T細(xì)胞的增殖的影響,同時(shí)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)T細(xì)胞早期活化標(biāo)志CD69的表達(dá)情況。結(jié)果顯示：sDC-SIGN可抑制Con A及anti-CD3/anti-CD28單抗所誘導(dǎo)的T細(xì)胞增殖,對(duì)CD8+T細(xì)胞增殖的抑制作用尤其顯著；能下調(diào)由Con A及anti-CD3/anti-CD28單抗所誘導(dǎo)的T細(xì)胞分泌IL-2、IFN-γ、IL-10及IL-17A,而對(duì)其IL-6分泌則呈現(xiàn)一定的促進(jìn)作用。資料提示,sDC-SIGN可能通過(guò)改變細(xì)胞因子之間的動(dòng)態(tài)平衡進(jìn)而影響T細(xì)胞的分化。我們還發(fā)現(xiàn)sDC-SIGN能下調(diào)ConA誘導(dǎo)的T細(xì)胞早期活化標(biāo)志CD-69的表達(dá)。這都為進(jìn)一步闡明sDC-SIGN的免疫調(diào)節(jié)功能提供了證據(jù),豐富了天然免疫指導(dǎo)獲得性免疫的內(nèi)容。 三、sDC-SIGN對(duì)T細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)功能的機(jī)制初探 前面工作我們已經(jīng)證實(shí),可溶性DC-SIGN存在于人體血漿中并且能夠影響T細(xì)胞的免疫應(yīng)答。進(jìn)一步,我們想知道sDC-SIGN可能通過(guò)哪部分與T結(jié)合。我們重組表達(dá)的sDC-SIGN由CRD區(qū)及頸區(qū)兩部分構(gòu)成。膜型DC-SIGN的CRD區(qū)可以以鈣離子依賴的方式結(jié)合特定的糖類(lèi)抗原,頸區(qū)主要參與被結(jié)合的糖寡聚化并調(diào)節(jié)糖的特異性,而有利于DC-SIGN與糖配體的結(jié)合。Cell ELISA結(jié)果顯示,在沒(méi)有Ca2+參與的條件下sDC-SIGN與T細(xì)胞的結(jié)合能力強(qiáng)于有Ca2+參與的的情況。我們?cè)诩?xì)胞培養(yǎng)時(shí)加入Ca2+檢測(cè)細(xì)胞因子分泌的情況,發(fā)現(xiàn)Ca2+的參與能夠逆轉(zhuǎn)sDC-SIGN對(duì)T細(xì)胞分泌IFN-γ、IL-10及IL-17A的抑制作用,同樣sDC-SIGN對(duì)T細(xì)胞分泌IL-6的促進(jìn)作用也得到一定程度的抑制。這提示我們sDC-SIGN可能不是通過(guò)CRD區(qū)結(jié)合T細(xì)胞發(fā)揮作用,或者sDC-SIGN的CRD區(qū)與其配體的結(jié)合可以不依賴Ca2+的存在。另外,我們?cè)诩?xì)胞培養(yǎng)時(shí)加入rhIL-2結(jié)果發(fā)現(xiàn),rhIL-2能夠逆轉(zhuǎn)sDC-SIGN對(duì)T細(xì)胞分泌IFN-γ的抑制作用,由此推斷,sDC-SIGN可能通過(guò)IL-2依賴的方式抑制T細(xì)胞的增殖。 綜上所述,我們檢測(cè)到人體中存在可溶性的DC-SIGN (sDC-SIGN),并且sDC-SIGN能夠影響T細(xì)胞的增殖,活化及細(xì)胞因子的分泌。sDC-SIGN對(duì)T細(xì)胞的免疫功能的影響可能是通過(guò)sDC-SIGN與T細(xì)胞直接結(jié)合發(fā)揮作用的,而sDC-SIGN與T細(xì)胞結(jié)合的部位可能不是其CRD區(qū)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類(lèi)號(hào)】：R392

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 劉瑩;左大明;盧曉;張麗蕓;陳政良;;人DC-SIGN全長(zhǎng)編碼區(qū)基因的克隆及其胞外段的原核表達(dá)[J];細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志;2009年05期

，

本文編號(hào)：1713264