發(fā)布時(shí)間：2018-04-04 18:24

  本文選題：DNA疫苗　切入點(diǎn)：DC靶向性　出處：《第二軍醫(yī)大學(xué)》2011年碩士論文

【摘要】：DNA疫苗在腫瘤免疫治療中具有巨大的應(yīng)用前景,臨床研究表明接受DNA疫苗免疫的病人能夠產(chǎn)生抗原特異性抗腫瘤免疫應(yīng)答,然而,目前的DNA疫苗免疫極少能誘導(dǎo)持久高效的抗腫瘤免疫反應(yīng),這表明DNA疫苗仍需不斷優(yōu)化。DNA疫苗起作用的一個(gè)很關(guān)鍵的環(huán)節(jié)是其表達(dá)的蛋白抗原需要被抗原提呈細(xì)胞(antigen presenting cells,APC)攝取,然后加工處理并提呈給抗原特異性T淋巴細(xì)胞,誘導(dǎo)T細(xì)胞活化及增殖。樹突狀細(xì)胞(dendritic cells,DC)是目前體內(nèi)已知的功能最強(qiáng)的抗原提呈細(xì)胞,其能夠刺激初始(na(?)ve)T細(xì)胞增殖進(jìn)而啟動(dòng)機(jī)體免疫應(yīng)答,誘導(dǎo)抗原特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)。皮下或肌肉注射質(zhì)粒DNA疫苗后,大部分質(zhì)粒被注射部位的皮膚及肌肉細(xì)胞攝取,其編碼的免疫抗原在這些細(xì)胞表達(dá)或釋放。皮膚和肌肉細(xì)胞因缺乏MHC II和共刺激分子表達(dá)不能有效遞呈抗原而不能致敏抗原特異性T細(xì)胞,因此DC的抗原攝取效率直接與誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)相關(guān)。在DNA疫苗免疫中,DC獲取免疫抗原主要有兩種途徑,一是局部少量DC直接攝取DNA質(zhì)粒并表達(dá)免疫抗原,這一途徑相對(duì)次要,畢竟局部能夠直接攝取質(zhì)粒DNA的DC比例極低。其二是局部DC攝取皮膚或肌肉細(xì)胞釋放的免疫抗原或吞噬表達(dá)免疫抗原的死亡皮膚肌肉細(xì)胞,這是主要途徑。因此,我們?cè)O(shè)想:通過DC靶向性分子(DC表面分子特異抗體或配體)把免疫抗原直接遞送至DC將能夠有效提高DC攝取抗原效率,進(jìn)而有效增強(qiáng)DNA疫苗誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答。 為驗(yàn)證上述假設(shè),本研究中我們制備了DC靶向性及對(duì)照的非靶向DNA疫苗scFv~(NLDC-145)-HER2/neu和HER2/neu,其中scFv~(NLDC-145)編碼DEC-205分子特異單鏈抗體片段,DEC-205是DC表面特異表達(dá)的吞噬受體,能夠有效介導(dǎo)抗原內(nèi)吞從而進(jìn)入抗原加工遞送通路;HER2/neu為原癌基因,編碼HER2/neu生長(zhǎng)因子受體,在乳腺癌等多種腫瘤中過表達(dá),其直接促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)及發(fā)展。實(shí)驗(yàn)表明:DC靶向性DNA疫苗能夠把編碼的免疫抗原有效的遞送至DC進(jìn)而被加工遞呈;在HER2/neu陽性的移植乳腺癌動(dòng)物模型中,與非靶向HER2/neu DNA疫苗相比,DC靶向疫苗誘導(dǎo)了顯著增強(qiáng)的HER2/neu特異細(xì)胞和體內(nèi)免疫應(yīng)答,能夠有效預(yù)防HER2/neu陽性小鼠腫瘤生長(zhǎng),并產(chǎn)生抗原特異性免疫記憶;更重要的是,DC靶向疫苗聯(lián)合低劑量環(huán)磷酰胺介導(dǎo)的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞短暫清除,能夠消除已生成的HER2陽性移植乳腺腫瘤,延緩BALB-neuT轉(zhuǎn)基因小鼠中自發(fā)性乳腺腫瘤生長(zhǎng)。 第一部分:DNA疫苗的構(gòu)建及表達(dá) 一、DNA疫苗的構(gòu)建:單鏈抗體片段NLDC-145(scFv~(NLDC-145))通過參考其他學(xué)者前期發(fā)表的文章全基因合成。HER2/neu的胞外區(qū)片段分別從SK-BR-3或TUBO乳腺癌細(xì)胞系擴(kuò)增出,測(cè)序正確后兩胞外區(qū)分別與scFv~(NLDC-145)經(jīng)overlapping PCR方法構(gòu)建出scFv~(NLDC-145)-HER2和scFv~(NLDC-145)-neu,兩PCR產(chǎn)物裝入pGEM-Teasy載體擴(kuò)增。我們用HindIII和XbaI雙酶切上述載體分別獲得scFv~(NLDC-145)-HER2和scFv~(NLDC-145)-neu片段,然后裝入經(jīng)相同酶切的pcDNA3.1(+)中成功構(gòu)建出含上述兩片段的表達(dá)載體。 二、DNA疫苗的融合蛋白表達(dá):抽提上述構(gòu)建的表達(dá)載體質(zhì)粒,瞬時(shí)轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,72h后收獲上清,用WB方法檢測(cè)質(zhì)粒疫苗的蛋白表達(dá),兩靶向疫苗表達(dá)的融合蛋白比預(yù)期的稍大,推測(cè)為融合蛋白在真核表達(dá)系統(tǒng)中存在糖基化的原因。 第二部分:DNA疫苗的體內(nèi)靶向性研究 一、構(gòu)建pcDNA3.1-scFv~(NLDC-145)-EGFP表達(dá)載體:從質(zhì)粒載體pEGFP-N1中克隆出EGFP基因,然后用EGFP基因替代上述表達(dá)載體scFv~(NLDC-145)-HER2中HER2片段,構(gòu)建成scFv~(NLDC-145)-EGFP表達(dá)載體。 二、scFv~(NLDC-145)體內(nèi)靶向性檢測(cè):用電擊免疫的方法在BALB/c小鼠右后大腿肌肉注射scFv~(NLDC-145)-EGFP質(zhì)粒,以PE標(biāo)記的CD11c陽性細(xì)胞設(shè)門,用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)EGFP綠色熒光,結(jié)果顯示scFv~(NLDC-145)具有良好的DC靶向性。 第三部分:BALB/c小鼠體內(nèi)抗腫瘤作用研究 一、預(yù)防性抗腫瘤作用: BALB/c小鼠隨機(jī)分為5組,對(duì)應(yīng)每組分別用電擊免疫的方法在小鼠右后大腿肌肉注射scFv~(NLDC-145)-HER2,scFv~(NLDC-145)-neu,HER2,neu和空載體pcDNA3.1,每只50μg/50μL。兩周之后再用相同的方法免疫第二次。BALB/c小鼠經(jīng)過兩次免疫一周后,在相反側(cè)背部皮下注射D2F2/E2細(xì)胞(D2F2/E2是穩(wěn)定表達(dá)HER2的人的乳腺癌細(xì)胞株),后觀察并記錄腫瘤生長(zhǎng)情況。結(jié)果顯示,靶向的scFv~(NLDC-145)-HER2組可有效預(yù)防腫瘤的生長(zhǎng),此組在120天時(shí)100%小鼠都成活,而其他組在80天時(shí)已全部死亡。有意思的是scFv~(NLDC-145)-neu組比非靶向的HER2,neu和pcDNA3.1組稍微有效的延緩了腫瘤生長(zhǎng)。 二、治療性抗腫瘤作用:首先驗(yàn)證DNA疫苗單獨(dú)應(yīng)用的抗腫瘤作用,BALB/c小鼠背部皮下接種D2F2/E2細(xì)胞,當(dāng)腫瘤直徑約40mm~3時(shí),上述方法兩次免疫小鼠,觀察腫瘤生長(zhǎng)情況。結(jié)果顯示,scFv~(NLDC-145)-HER2組比其他組雖然有明顯的抑瘤效果,但到120天時(shí)該組也才只有20%小鼠生存,所以scFv~(NLDC-145)-HER2單獨(dú)應(yīng)用作用有限。隨后我們驗(yàn)證DNA疫苗聯(lián)合應(yīng)用環(huán)磷酰胺抗腫瘤作用,BALB/c小鼠接種D2F2/E2細(xì)胞,當(dāng)腫瘤直徑約3-4mm時(shí),腹腔注射低劑量的環(huán)磷酰胺(100mg/kg),四天后小鼠按照上述方法免疫兩次,后觀察腫瘤生長(zhǎng)情況。結(jié)果顯示,scFv~(NLDC-145)-HER2聯(lián)合環(huán)磷酰胺組在120時(shí)能顯著抑制80%小鼠腫瘤生長(zhǎng)并能使腫瘤體積減小至消除,其他各聯(lián)合應(yīng)用組也比對(duì)應(yīng)的單獨(dú)應(yīng)用質(zhì)粒免疫有好的抑瘤效果。 第四部分:DNA疫苗的抗腫瘤機(jī)制研究 一、誘導(dǎo)HER2特異性T細(xì)胞反應(yīng):上述方法兩次免疫BALB/c小鼠,一周后,取脾單細(xì)胞分別用HER2或TRP2蛋白體外刺激3天,通過液相閃爍計(jì)數(shù)儀檢測(cè)后可知scFv~(NLDC-145)-HER2組經(jīng)HER2蛋白刺激的比TRP2蛋白刺激的有顯著的T細(xì)胞增殖。同樣都是經(jīng)HER2蛋白刺激的各組比較,結(jié)果顯示scFv~(NLDC-145)-HER2組也比其他組有顯著的T細(xì)胞增殖,而scFv~(NLDC-145)-neu組也比其他各非靶向?qū)φ战M的T細(xì)胞增殖稍顯著。ELISA檢測(cè)上述經(jīng)HER2蛋白刺激的各組的培養(yǎng)脾細(xì)胞的血清,scFv~(NLDC-145)-HER2組可檢測(cè)IFN-γ, TNF-α的高表達(dá),同樣scFv~(NLDC-145)-neu組IFN-γ, TNF-α的表達(dá)也略高于其他各非靶向?qū)φ战M。流式檢測(cè)經(jīng)HER2肽段刺激的scFv~(NLDC-145)-HER2組有CD4+ IFN-γ+,CD4+ TNF-α+,CD8+ IFN-γ+和CD8+ TNF-α+ T細(xì)胞高表達(dá)。 二、誘導(dǎo)HER2特異性抗體反應(yīng):收集上述各組的血清,ELISA可檢測(cè)到scFv~(NLDC-145)-HER2組比其他各組有高滴度的HER2特異性抗體,且主要為IgG2a亞型。另上清與D2F2/E2細(xì)胞孵育,后與FITC標(biāo)記的二抗結(jié)合孵育后流式檢測(cè)scFv~(NLDC-145)-HER2組D2F2/E2特異性抗體明顯高于其他組,而scFv~(NLDC-145)-neu也略高于各非靶向組。 第五部分:scFv~(NLDC-145)-neu在BALB-neuT小鼠中抗腫瘤作用研究 一、預(yù)防性抗腫瘤作用:建立穩(wěn)定表達(dá)neu抗原的小鼠乳腺癌細(xì)胞株TUBO可移植腫瘤模型;在BALB-neuT小鼠經(jīng)過兩次免疫一周后,在相反側(cè)背部皮下注射TUBO細(xì)胞,后觀察腫瘤生長(zhǎng)情況。結(jié)果顯示,靶向的scFv~(NLDC-145)-neu組可預(yù)防腫瘤的生長(zhǎng),此組在120天時(shí)約90%小鼠都成活,而其他組在不到60天時(shí)已全部死亡。 二、抗小鼠自發(fā)性乳腺癌作用:BALB-neuT小鼠是表達(dá)neu抗原的可自發(fā)性生長(zhǎng)乳腺癌的小鼠,在小鼠8周和10周時(shí)用電擊免疫的方法肌肉注射scFv~(NLDC-145)-neu+CTX , scFv~(NLDC-145)-neu , neu , pcDNA3.1和PBS ,其中scFv~(NLDC-145)-neu+CTX組在第一次免疫的4天前注射低劑量的環(huán)磷酰胺(100mg/kg),再肌肉注射scFv~(NLDC-145)-neu,后觀察各組小鼠自發(fā)性腫瘤個(gè)數(shù)。結(jié)果顯示,scFv~(NLDC-145)-neu聯(lián)合環(huán)磷酰胺組可有效延緩自發(fā)性腫瘤生長(zhǎng),比其他組延緩約4周生長(zhǎng)腫瘤。到第38周時(shí),環(huán)磷酰胺聯(lián)合應(yīng)用組小鼠還都活著,而非靶向?qū)φ战M在26周時(shí)就已死亡或腫瘤體積超過1500mm~3,另scFv~(NLDC-145)-neu單獨(dú)應(yīng)用組效果也好于其他各非靶向組,該組絕大部分小鼠在30周時(shí)還生存著。 結(jié)論: 綜上所述我們構(gòu)建的DC靶向性的DNA疫苗在小鼠體內(nèi)可以把腫瘤特異性抗原靶向到DC表面,從而引起抗原特異性的細(xì)胞和體液免疫,更重要的若聯(lián)合低劑量的環(huán)磷酰胺短暫清除調(diào)節(jié)性T細(xì)胞后,其作為治療性疫苗能在小鼠體內(nèi)起到較好的抗腫瘤作用,從而為腫瘤治療提供一個(gè)潛在可行的治療策略。
[Abstract]:DNA vaccine has a great potential in tumor immunotherapy , and clinical research shows that patients immunized with DNA vaccine can produce antigen - specific anti - tumor immune response .

In order to validate the above hypothesis , we prepared a non - targeted DNA vaccine scFv ~ ( NLDC - 145 ) - HER2 / neu and HER2 / neu , wherein scFv ~ ( NLDC - 145 ) encodes a specific single - chain antibody fragment of DEC - 205 .

Part I : Construction and Expression of DNA Vaccine

1 . Construction of DNA vaccine : Single - chain antibody fragment NLDC - 145 ( scFv ~ ( NLDC - 145 )) was amplified from SK - BR - 3 or TUBO breast cancer cell line . The two extracellular domains were amplified from SK - BR - 3 or TUBO breast cancer cell lines . The two extracellular domains were amplified by overlapping PCR method . The scFv ~ ( NLDC - 145 ) - HER2 and scFv ~ ( NLDC - 145 ) - neu fragments were respectively obtained by overlapping PCR .

2 . Expression of the fusion protein of DNA vaccine : the expression vector plasmid constructed above was extracted , transiently transfected into 293 cells , the supernatant was harvested after 72 h , the protein expression of the plasmid vaccine was detected by WB method , the fusion protein expressed by the two target vaccines was slightly larger than expected , and it was speculated that the fusion protein had glycosylation in the eukaryotic expression system .

Second part : In vivo targeting of DNA vaccines

1 . Construction of pcDNA3.1 - scFv ~ ( NLDC - 145 ) - EGFP expression vector : The EGFP gene was cloned from the plasmid pcDNA3.1 - scFv ~ ( NLDC - 145 ) - EGFP , and then the expression vector scFv ~ ( NLDC - 145 ) - HER2 was replaced by EGFP gene to construct the scFv ~ ( NLDC - 145 ) - EGFP expression vector .

2 . In vivo targeting detection of scFv ~ ( NLDC - 145 ) : Using electric shock immunity method , the scFv ~ ( NLDC - 145 ) - EGFP plasmid was injected into the right posterior thigh muscle of BALB / c mice . The cells of CD11c - positive cells marked by PE were constructed . The green fluorescence of EGFP was detected by flow cytometry . The results showed that the scFv ~ ( NLDC - 145 ) had good DC targeting .

The third part : the anti - tumor effect of BALB / c mice

1 . Preventive anti - tumor effect : BALB / c mice were randomly divided into 5 groups . Each group was immunized with the same method after two weeks of immunization . The target scFv ~ ( NLDC - 145 ) - HER2 group was able to effectively prevent tumor growth . The results showed that the targeted scFv ~ ( NLDC - 145 ) - HER2 group could effectively prevent tumor growth . The target scFv ~ ( NLDC - 145 ) - HER2 group had died at 80 days . Interestingly , the scFv ~ ( NLDC - 145 ) - neu group had delayed tumor growth more effectively than non - targeted HER2 , neu and pcDNA3.1 groups .

The results showed that scFv ~ ( NLDC - 145 ) - HER2 combined with cyclophosphamide ( 100 mg / kg ) could significantly inhibit tumor growth of 80 % mice at 120 days , and then observe the growth of tumor . The results showed that the scFv ~ ( NLDC - 145 ) - HER2 combined cyclophosphamide group could significantly inhibit tumor growth of 80 % mice at 120 days and reduce tumor volume to elimination .

Part IV : Study on the Anti - tumor Mechanism of DNA Vaccine

The results showed that scFv ~ ( NLDC - 145 ) - HER2 group was significantly higher than that of other non - targeted control groups . The results showed that the scFv ~ ( NLDC - 145 ) - HER2 group was significantly higher than that of other non - targeted control groups .

2 . To induce HER2 specific antibody reaction : the serum of the above groups was collected , and the specific antibody of HER2 specific antibody with high titer was detected by ELISA . The specific antibody of scFv ~ ( NLDC - 145 ) - HER2 was significantly higher than that of other groups after incubation with D2F2 / E2 cells . The specific antibody of scFv ~ ( NLDC - 145 ) - HER2 was higher than that of other groups , and the scFv ~ ( NLDC - 145 ) - neu was also slightly higher than that of non - targeting groups .

The antitumor effect of scFv ~ ( NLDC - 145 ) - neu in BALB / neuT mice

1 . Preventive anti - tumor effect : A mouse breast cancer cell line TUBO transplantable tumor model stably expressing neu antigen was established . After two weeks of immunization in BALB / neuT mice , TUBO cells were injected subcutaneously on the opposite side , then the growth of tumor was observed . The results showed that the targeted scFv ~ ( NLDC - 145 ) - neu group could prevent tumor growth , and the target scFv ~ ( NLDC - 145 ) - neu group was alive at 120 days , while the other groups died in less than 60 days .

The results showed that scFv ~ ( NLDC - 145 ) - neu combined cyclophosphamide group could effectively delay the growth of spontaneous tumor . The results showed that scFv ~ ( NLDC - 145 ) - neu combined cyclophosphamide group could effectively delay the growth of spontaneous tumor . The results showed that scFv ~ ( NLDC - 145 ) - neu combined cyclophosphamide group could effectively delay the growth of spontaneous tumor . The results showed that scFv ~ ( NLDC - 145 ) - neu combined cyclophosphamide group could effectively delay the growth of spontaneous tumor . The results showed that scFv ~ ( NLDC - 145 ) - neu combined cyclophosphamide group could effectively delay the growth of spontaneous tumor .

Conclusion :

In conclusion , the DC - targeted DNA vaccine can target the tumor - specific antigen to the DC surface in vivo , thus causing antigen - specific cellular and humoral immunity , and more importantly , when the combined low - dose cyclophosphamide transiently clears the regulatory T cell , it can play a better anti - tumor effect in the mouse body as a therapeutic vaccine , thereby providing a potentially feasible treatment strategy for tumor treatment .

【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號(hào)】：R392

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10 馮愛書;非典型雞新城疫防治淺析[N];中國(guó)畜牧獸醫(yī)報(bào);2006年

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1 宮強(qiáng);牛結(jié)核病DNA疫苗的研究[D];中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2007年

2 李金福;杜氏利什曼原蟲amastin基因DNA疫苗的初步研究[D];四川大學(xué);2007年

3 查園園;基因槍介導(dǎo)的neu基因DNA疫苗抗腫瘤作用的實(shí)驗(yàn)研究[D];中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué);2002年

4 王政;小兒腎母細(xì)胞瘤免疫治療的初步研究[D];中國(guó)人民解放軍軍醫(yī)進(jìn)修學(xué)院;2007年

5 李擎天;重組百日咳DNA疫苗實(shí)驗(yàn)研究[D];中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué);2007年

6 李宇紅;增強(qiáng)靶向融合防齲DNA疫苗粘膜免疫效果的研究[D];武漢大學(xué);2005年

7 張洪英;口蹄疫多表位DNA疫苗的免疫原性和安全性研究[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2003年

8 張靜;輪狀病毒分子流行病學(xué)調(diào)查及脂質(zhì)體DNA疫苗研究[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2002年

9 王濤;嗜肺軍團(tuán)菌mip基因DNA疫苗初步研究[D];四川大學(xué);2004年

10 宋立強(qiáng);異種同源鈣激活Cl～-通道DNA疫苗對(duì)小鼠哮喘模型的防治作用[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2004年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 于永生;DC靶向性DNA疫苗抗腫瘤作用及機(jī)制研究[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2011年

2 賈文影;新孢子蟲PO基因的真核表達(dá)及DNA疫苗的初步研究[D];延邊大學(xué);2010年

3 熊杰;禽流感DNA疫苗在雞體的生物學(xué)分布研究[D];四川農(nóng)業(yè)大學(xué);2010年

4 張志曉;利用生物信息學(xué)方法制備尖吻蝮蛇蛇毒DNA疫苗[D];云南大學(xué);2010年

5 仲凱勵(lì);B細(xì)胞淋巴瘤獨(dú)特型DNA疫苗誘導(dǎo)特異性免疫反應(yīng)的實(shí)驗(yàn)研究[D];中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院;2003年

6 周麗麗;布魯氏菌BLS-L7/L12重組亞單位疫苗的初步研究[D];中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院;2007年

7 張術(shù);偽狂犬病核酸疫苗及其佐劑的研究[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2005年

8 張恒;雞貧血病毒DNA疫苗的研究[D];山東師范大學(xué);2003年

9 曾政;布魯氏菌新型疫苗的構(gòu)建及其免疫原性研究[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2004年

10 任清;狂犬病毒糖蛋白DNA疫苗的構(gòu)建及其誘導(dǎo)小鼠的免疫應(yīng)答[D];吉林大學(xué);2006年

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本文編號(hào)：1711153