本文選題：DNA疫苗　切入點：DC靶向性　出處：《第二軍醫(yī)大學》2011年碩士論文

【摘要】：DNA疫苗在腫瘤免疫治療中具有巨大的應(yīng)用前景,臨床研究表明接受DNA疫苗免疫的病人能夠產(chǎn)生抗原特異性抗腫瘤免疫應(yīng)答,然而,目前的DNA疫苗免疫極少能誘導持久高效的抗腫瘤免疫反應(yīng),這表明DNA疫苗仍需不斷優(yōu)化。DNA疫苗起作用的一個很關(guān)鍵的環(huán)節(jié)是其表達的蛋白抗原需要被抗原提呈細胞(antigen presenting cells,APC)攝取,然后加工處理并提呈給抗原特異性T淋巴細胞,誘導T細胞活化及增殖。樹突狀細胞(dendritic cells,DC)是目前體內(nèi)已知的功能最強的抗原提呈細胞,其能夠刺激初始(na(?)ve)T細胞增殖進而啟動機體免疫應(yīng)答,誘導抗原特異性細胞免疫反應(yīng)。皮下或肌肉注射質(zhì)粒DNA疫苗后,大部分質(zhì)粒被注射部位的皮膚及肌肉細胞攝取,其編碼的免疫抗原在這些細胞表達或釋放。皮膚和肌肉細胞因缺乏MHC II和共刺激分子表達不能有效遞呈抗原而不能致敏抗原特異性T細胞,因此DC的抗原攝取效率直接與誘導的免疫反應(yīng)相關(guān)。在DNA疫苗免疫中,DC獲取免疫抗原主要有兩種途徑,一是局部少量DC直接攝取DNA質(zhì)粒并表達免疫抗原,這一途徑相對次要,畢竟局部能夠直接攝取質(zhì)粒DNA的DC比例極低。其二是局部DC攝取皮膚或肌肉細胞釋放的免疫抗原或吞噬表達免疫抗原的死亡皮膚肌肉細胞,這是主要途徑。因此,我們設(shè)想:通過DC靶向性分子(DC表面分子特異抗體或配體)把免疫抗原直接遞送至DC將能夠有效提高DC攝取抗原效率,進而有效增強DNA疫苗誘導的免疫應(yīng)答。 為驗證上述假設(shè),本研究中我們制備了DC靶向性及對照的非靶向DNA疫苗scFv~(NLDC-145)-HER2/neu和HER2/neu,其中scFv~(NLDC-145)編碼DEC-205分子特異單鏈抗體片段,DEC-205是DC表面特異表達的吞噬受體,能夠有效介導抗原內(nèi)吞從而進入抗原加工遞送通路;HER2/neu為原癌基因,編碼HER2/neu生長因子受體,在乳腺癌等多種腫瘤中過表達,其直接促進腫瘤生長及發(fā)展。實驗表明:DC靶向性DNA疫苗能夠把編碼的免疫抗原有效的遞送至DC進而被加工遞呈;在HER2/neu陽性的移植乳腺癌動物模型中,與非靶向HER2/neu DNA疫苗相比,DC靶向疫苗誘導了顯著增強的HER2/neu特異細胞和體內(nèi)免疫應(yīng)答,能夠有效預防HER2/neu陽性小鼠腫瘤生長,并產(chǎn)生抗原特異性免疫記憶;更重要的是,DC靶向疫苗聯(lián)合低劑量環(huán)磷酰胺介導的調(diào)節(jié)性T細胞短暫清除,能夠消除已生成的HER2陽性移植乳腺腫瘤,延緩BALB-neuT轉(zhuǎn)基因小鼠中自發(fā)性乳腺腫瘤生長。 第一部分:DNA疫苗的構(gòu)建及表達 一、DNA疫苗的構(gòu)建:單鏈抗體片段NLDC-145(scFv~(NLDC-145))通過參考其他學者前期發(fā)表的文章全基因合成。HER2/neu的胞外區(qū)片段分別從SK-BR-3或TUBO乳腺癌細胞系擴增出,測序正確后兩胞外區(qū)分別與scFv~(NLDC-145)經(jīng)overlapping PCR方法構(gòu)建出scFv~(NLDC-145)-HER2和scFv~(NLDC-145)-neu,兩PCR產(chǎn)物裝入pGEM-Teasy載體擴增。我們用HindIII和XbaI雙酶切上述載體分別獲得scFv~(NLDC-145)-HER2和scFv~(NLDC-145)-neu片段,然后裝入經(jīng)相同酶切的pcDNA3.1(+)中成功構(gòu)建出含上述兩片段的表達載體。 二、DNA疫苗的融合蛋白表達:抽提上述構(gòu)建的表達載體質(zhì)粒,瞬時轉(zhuǎn)染293T細胞,72h后收獲上清,用WB方法檢測質(zhì)粒疫苗的蛋白表達,兩靶向疫苗表達的融合蛋白比預期的稍大,推測為融合蛋白在真核表達系統(tǒng)中存在糖基化的原因。 第二部分:DNA疫苗的體內(nèi)靶向性研究 一、構(gòu)建pcDNA3.1-scFv~(NLDC-145)-EGFP表達載體:從質(zhì)粒載體pEGFP-N1中克隆出EGFP基因,然后用EGFP基因替代上述表達載體scFv~(NLDC-145)-HER2中HER2片段,構(gòu)建成scFv~(NLDC-145)-EGFP表達載體。 二、scFv~(NLDC-145)體內(nèi)靶向性檢測:用電擊免疫的方法在BALB/c小鼠右后大腿肌肉注射scFv~(NLDC-145)-EGFP質(zhì)粒,以PE標記的CD11c陽性細胞設(shè)門,用流式細胞術(shù)檢測EGFP綠色熒光,結(jié)果顯示scFv~(NLDC-145)具有良好的DC靶向性。 第三部分:BALB/c小鼠體內(nèi)抗腫瘤作用研究 一、預防性抗腫瘤作用: BALB/c小鼠隨機分為5組,對應(yīng)每組分別用電擊免疫的方法在小鼠右后大腿肌肉注射scFv~(NLDC-145)-HER2,scFv~(NLDC-145)-neu,HER2,neu和空載體pcDNA3.1,每只50μg/50μL。兩周之后再用相同的方法免疫第二次。BALB/c小鼠經(jīng)過兩次免疫一周后,在相反側(cè)背部皮下注射D2F2/E2細胞(D2F2/E2是穩(wěn)定表達HER2的人的乳腺癌細胞株),后觀察并記錄腫瘤生長情況。結(jié)果顯示,靶向的scFv~(NLDC-145)-HER2組可有效預防腫瘤的生長,此組在120天時100%小鼠都成活,而其他組在80天時已全部死亡。有意思的是scFv~(NLDC-145)-neu組比非靶向的HER2,neu和pcDNA3.1組稍微有效的延緩了腫瘤生長。 二、治療性抗腫瘤作用:首先驗證DNA疫苗單獨應(yīng)用的抗腫瘤作用,BALB/c小鼠背部皮下接種D2F2/E2細胞,當腫瘤直徑約40mm~3時,上述方法兩次免疫小鼠,觀察腫瘤生長情況。結(jié)果顯示,scFv~(NLDC-145)-HER2組比其他組雖然有明顯的抑瘤效果,但到120天時該組也才只有20%小鼠生存,所以scFv~(NLDC-145)-HER2單獨應(yīng)用作用有限。隨后我們驗證DNA疫苗聯(lián)合應(yīng)用環(huán)磷酰胺抗腫瘤作用,BALB/c小鼠接種D2F2/E2細胞,當腫瘤直徑約3-4mm時,腹腔注射低劑量的環(huán)磷酰胺(100mg/kg),四天后小鼠按照上述方法免疫兩次,后觀察腫瘤生長情況。結(jié)果顯示,scFv~(NLDC-145)-HER2聯(lián)合環(huán)磷酰胺組在120時能顯著抑制80%小鼠腫瘤生長并能使腫瘤體積減小至消除,其他各聯(lián)合應(yīng)用組也比對應(yīng)的單獨應(yīng)用質(zhì)粒免疫有好的抑瘤效果。 第四部分:DNA疫苗的抗腫瘤機制研究 一、誘導HER2特異性T細胞反應(yīng):上述方法兩次免疫BALB/c小鼠,一周后,取脾單細胞分別用HER2或TRP2蛋白體外刺激3天,通過液相閃爍計數(shù)儀檢測后可知scFv~(NLDC-145)-HER2組經(jīng)HER2蛋白刺激的比TRP2蛋白刺激的有顯著的T細胞增殖。同樣都是經(jīng)HER2蛋白刺激的各組比較,結(jié)果顯示scFv~(NLDC-145)-HER2組也比其他組有顯著的T細胞增殖,而scFv~(NLDC-145)-neu組也比其他各非靶向?qū)φ战M的T細胞增殖稍顯著。ELISA檢測上述經(jīng)HER2蛋白刺激的各組的培養(yǎng)脾細胞的血清,scFv~(NLDC-145)-HER2組可檢測IFN-γ, TNF-α的高表達,同樣scFv~(NLDC-145)-neu組IFN-γ, TNF-α的表達也略高于其他各非靶向?qū)φ战M。流式檢測經(jīng)HER2肽段刺激的scFv~(NLDC-145)-HER2組有CD4+ IFN-γ+,CD4+ TNF-α+,CD8+ IFN-γ+和CD8+ TNF-α+ T細胞高表達。 二、誘導HER2特異性抗體反應(yīng):收集上述各組的血清,ELISA可檢測到scFv~(NLDC-145)-HER2組比其他各組有高滴度的HER2特異性抗體,且主要為IgG2a亞型。另上清與D2F2/E2細胞孵育,后與FITC標記的二抗結(jié)合孵育后流式檢測scFv~(NLDC-145)-HER2組D2F2/E2特異性抗體明顯高于其他組,而scFv~(NLDC-145)-neu也略高于各非靶向組。 第五部分:scFv~(NLDC-145)-neu在BALB-neuT小鼠中抗腫瘤作用研究 一、預防性抗腫瘤作用:建立穩(wěn)定表達neu抗原的小鼠乳腺癌細胞株TUBO可移植腫瘤模型;在BALB-neuT小鼠經(jīng)過兩次免疫一周后,在相反側(cè)背部皮下注射TUBO細胞,后觀察腫瘤生長情況。結(jié)果顯示,靶向的scFv~(NLDC-145)-neu組可預防腫瘤的生長,此組在120天時約90%小鼠都成活,而其他組在不到60天時已全部死亡。 二、抗小鼠自發(fā)性乳腺癌作用:BALB-neuT小鼠是表達neu抗原的可自發(fā)性生長乳腺癌的小鼠,在小鼠8周和10周時用電擊免疫的方法肌肉注射scFv~(NLDC-145)-neu+CTX , scFv~(NLDC-145)-neu , neu , pcDNA3.1和PBS ,其中scFv~(NLDC-145)-neu+CTX組在第一次免疫的4天前注射低劑量的環(huán)磷酰胺(100mg/kg),再肌肉注射scFv~(NLDC-145)-neu,后觀察各組小鼠自發(fā)性腫瘤個數(shù)。結(jié)果顯示,scFv~(NLDC-145)-neu聯(lián)合環(huán)磷酰胺組可有效延緩自發(fā)性腫瘤生長,比其他組延緩約4周生長腫瘤。到第38周時,環(huán)磷酰胺聯(lián)合應(yīng)用組小鼠還都活著,而非靶向?qū)φ战M在26周時就已死亡或腫瘤體積超過1500mm~3,另scFv~(NLDC-145)-neu單獨應(yīng)用組效果也好于其他各非靶向組,該組絕大部分小鼠在30周時還生存著。 結(jié)論: 綜上所述我們構(gòu)建的DC靶向性的DNA疫苗在小鼠體內(nèi)可以把腫瘤特異性抗原靶向到DC表面,從而引起抗原特異性的細胞和體液免疫,更重要的若聯(lián)合低劑量的環(huán)磷酰胺短暫清除調(diào)節(jié)性T細胞后,其作為治療性疫苗能在小鼠體內(nèi)起到較好的抗腫瘤作用,從而為腫瘤治療提供一個潛在可行的治療策略。
[Abstract]:DNA vaccine has a great potential in tumor immunotherapy , and clinical research shows that patients immunized with DNA vaccine can produce antigen - specific anti - tumor immune response .

In order to validate the above hypothesis , we prepared a non - targeted DNA vaccine scFv ~ ( NLDC - 145 ) - HER2 / neu and HER2 / neu , wherein scFv ~ ( NLDC - 145 ) encodes a specific single - chain antibody fragment of DEC - 205 .

Part I : Construction and Expression of DNA Vaccine

1 . Construction of DNA vaccine : Single - chain antibody fragment NLDC - 145 ( scFv ~ ( NLDC - 145 )) was amplified from SK - BR - 3 or TUBO breast cancer cell line . The two extracellular domains were amplified from SK - BR - 3 or TUBO breast cancer cell lines . The two extracellular domains were amplified by overlapping PCR method . The scFv ~ ( NLDC - 145 ) - HER2 and scFv ~ ( NLDC - 145 ) - neu fragments were respectively obtained by overlapping PCR .

2 . Expression of the fusion protein of DNA vaccine : the expression vector plasmid constructed above was extracted , transiently transfected into 293 cells , the supernatant was harvested after 72 h , the protein expression of the plasmid vaccine was detected by WB method , the fusion protein expressed by the two target vaccines was slightly larger than expected , and it was speculated that the fusion protein had glycosylation in the eukaryotic expression system .

Second part : In vivo targeting of DNA vaccines

1 . Construction of pcDNA3.1 - scFv ~ ( NLDC - 145 ) - EGFP expression vector : The EGFP gene was cloned from the plasmid pcDNA3.1 - scFv ~ ( NLDC - 145 ) - EGFP , and then the expression vector scFv ~ ( NLDC - 145 ) - HER2 was replaced by EGFP gene to construct the scFv ~ ( NLDC - 145 ) - EGFP expression vector .

2 . In vivo targeting detection of scFv ~ ( NLDC - 145 ) : Using electric shock immunity method , the scFv ~ ( NLDC - 145 ) - EGFP plasmid was injected into the right posterior thigh muscle of BALB / c mice . The cells of CD11c - positive cells marked by PE were constructed . The green fluorescence of EGFP was detected by flow cytometry . The results showed that the scFv ~ ( NLDC - 145 ) had good DC targeting .

The third part : the anti - tumor effect of BALB / c mice

1 . Preventive anti - tumor effect : BALB / c mice were randomly divided into 5 groups . Each group was immunized with the same method after two weeks of immunization . The target scFv ~ ( NLDC - 145 ) - HER2 group was able to effectively prevent tumor growth . The results showed that the targeted scFv ~ ( NLDC - 145 ) - HER2 group could effectively prevent tumor growth . The target scFv ~ ( NLDC - 145 ) - HER2 group had died at 80 days . Interestingly , the scFv ~ ( NLDC - 145 ) - neu group had delayed tumor growth more effectively than non - targeted HER2 , neu and pcDNA3.1 groups .

The results showed that scFv ~ ( NLDC - 145 ) - HER2 combined with cyclophosphamide ( 100 mg / kg ) could significantly inhibit tumor growth of 80 % mice at 120 days , and then observe the growth of tumor . The results showed that the scFv ~ ( NLDC - 145 ) - HER2 combined cyclophosphamide group could significantly inhibit tumor growth of 80 % mice at 120 days and reduce tumor volume to elimination .

Part IV : Study on the Anti - tumor Mechanism of DNA Vaccine

The results showed that scFv ~ ( NLDC - 145 ) - HER2 group was significantly higher than that of other non - targeted control groups . The results showed that the scFv ~ ( NLDC - 145 ) - HER2 group was significantly higher than that of other non - targeted control groups .

2 . To induce HER2 specific antibody reaction : the serum of the above groups was collected , and the specific antibody of HER2 specific antibody with high titer was detected by ELISA . The specific antibody of scFv ~ ( NLDC - 145 ) - HER2 was significantly higher than that of other groups after incubation with D2F2 / E2 cells . The specific antibody of scFv ~ ( NLDC - 145 ) - HER2 was higher than that of other groups , and the scFv ~ ( NLDC - 145 ) - neu was also slightly higher than that of non - targeting groups .

The antitumor effect of scFv ~ ( NLDC - 145 ) - neu in BALB / neuT mice

1 . Preventive anti - tumor effect : A mouse breast cancer cell line TUBO transplantable tumor model stably expressing neu antigen was established . After two weeks of immunization in BALB / neuT mice , TUBO cells were injected subcutaneously on the opposite side , then the growth of tumor was observed . The results showed that the targeted scFv ~ ( NLDC - 145 ) - neu group could prevent tumor growth , and the target scFv ~ ( NLDC - 145 ) - neu group was alive at 120 days , while the other groups died in less than 60 days .

The results showed that scFv ~ ( NLDC - 145 ) - neu combined cyclophosphamide group could effectively delay the growth of spontaneous tumor . The results showed that scFv ~ ( NLDC - 145 ) - neu combined cyclophosphamide group could effectively delay the growth of spontaneous tumor . The results showed that scFv ~ ( NLDC - 145 ) - neu combined cyclophosphamide group could effectively delay the growth of spontaneous tumor . The results showed that scFv ~ ( NLDC - 145 ) - neu combined cyclophosphamide group could effectively delay the growth of spontaneous tumor . The results showed that scFv ~ ( NLDC - 145 ) - neu combined cyclophosphamide group could effectively delay the growth of spontaneous tumor .

Conclusion :

In conclusion , the DC - targeted DNA vaccine can target the tumor - specific antigen to the DC surface in vivo , thus causing antigen - specific cellular and humoral immunity , and more importantly , when the combined low - dose cyclophosphamide transiently clears the regulatory T cell , it can play a better anti - tumor effect in the mouse body as a therapeutic vaccine , thereby providing a potentially feasible treatment strategy for tumor treatment .

【學位授予單位】：第二軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2011
【分類號】：R392

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本文編號：1711153