本文選題：甲型H1N1流感病毒　切入點(diǎn)：重組桿狀病毒　出處：《華中農(nóng)業(yè)大學(xué)》2011年碩士論文

【摘要】：流感是一種急性的經(jīng)呼吸道傳染的疾病,無(wú)論是對(duì)動(dòng)物養(yǎng)殖業(yè)還是人類健康均造成嚴(yán)重的危害。2009年4月,墨西哥、美國(guó)等國(guó)家相繼爆發(fā)了豬源甲型H1N1流感的疫情,之后迅速蔓延至全球范圍內(nèi)的許多國(guó)家和地區(qū)。同年6月,世界衛(wèi)生組織將此次流感流行的預(yù)警級(jí)別提升至6級(jí)。針對(duì)如此大的疫情,疫苗接種是預(yù)防和控制流感流行最有效的方法,流感病毒滅活疫苗是目前用于預(yù)防流感最為廣泛的疫苗。盡管滅活疫苗保護(hù)率較好,但仍存在著不足,如制備周期較長(zhǎng)、需要大量雞胚,另外少數(shù)個(gè)體在疫苗接種后會(huì)產(chǎn)生不良反應(yīng)。因此,科研工作者一直在試圖研制一種更安全、更高效的流感疫苗。 桿狀病毒一直被用于在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)外源蛋白。最近的研究報(bào)道,表明桿狀病毒載體在真核生物啟動(dòng)子的驅(qū)動(dòng)下可以轉(zhuǎn)導(dǎo)不同類型的哺乳動(dòng)物細(xì)胞并表達(dá)外源基因,同樣基因在不同啟動(dòng)子的控制下,其表達(dá)水平也會(huì)有很大的差異,且經(jīng)水泡性口膜炎病毒G蛋白(VSV/G)修飾的桿狀病毒,其宿主范圍更廣,在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率更高。 鑒于此,本研究對(duì)甲型H1N1流感基因工程疫苗進(jìn)行新的探索,構(gòu)建了兩種啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)甲型H1N1流感免疫原性蛋白表達(dá)的重組桿狀病毒疫苗,并在小鼠模型上對(duì)所構(gòu)建的疫苗進(jìn)行免疫效力評(píng)價(jià),主要研究?jī)?nèi)容如下： 1重組桿狀病毒BV-CMV-HA/M1/NA和BV-ie1-HA/M1/NA的構(gòu)建 利用對(duì)蝦白斑綜合癥病毒(white spot syndrome virus, WSSV)的iel啟動(dòng)子和人巨細(xì)胞病毒的CMV啟動(dòng)子分別構(gòu)建了囊膜表面展示有VSV-G蛋白重組桿狀病毒,兩種啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的重組桿狀病毒都介導(dǎo)甲型H1N1流感新型基因工程疫苗BV-CMV-HA/M1/NA和BV-ie1-HA/M1/NA。 2多克隆抗體的制備和重組桿狀病毒BV-CMV-HA/M1/NA、BV-ie1-HA/M1/NA的體外表達(dá)分析 在HA序列的基礎(chǔ)上,設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增HA的亞基(tHA1),用基因工程方法,構(gòu)建原核表達(dá)質(zhì)粒pET28a-tHA1,將原核表達(dá)質(zhì)粒pET28a-tHA1轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)細(xì)胞,通過(guò)IPTG誘導(dǎo)獲得了以包涵體形式表達(dá)的重組蛋白。將重組蛋白tHA1進(jìn)行SDS-PAGE電泳,將目的蛋白從蛋白膠上割下,稱量,用研缽研磨至糊狀后在小鼠背部多點(diǎn)皮下注射,注射劑量為200uL。間隔兩周,再次同上方法注射,后每周加強(qiáng)免疫一次,并每周采血檢測(cè)抗體,至抗體符合要求時(shí),即對(duì)小鼠進(jìn)行眼眶采血大量收集血清,即為鼠源多克隆抗體。 為證實(shí)重組桿狀病毒在體內(nèi)能否有效表達(dá)外源蛋白,將重組桿狀病毒BV-CMV-HA/M1/NA和BV-ie1-HA/M1/NA轉(zhuǎn)導(dǎo)BHK-21細(xì)胞,IFA試驗(yàn)表明,重組桿狀病毒BV-CMV-HA/M1/NA和BV-ie1-HA/M1/NA均能夠在體外表達(dá)外源蛋白。 3重組桿狀病毒BV-CMV-HA/Ml/NA和BV-iel-HA/Ml/NA在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)的免疫原性評(píng)價(jià) 為探討重組桿狀病毒疫苗的免疫效果,以1×109PFU/只的劑量免疫BLAB/c小鼠,同時(shí)用甲型H1N1流感病毒滅活疫苗做對(duì)照。結(jié)果表明：在細(xì)胞免疫方面,兩種重組桿狀病毒均產(chǎn)生了較好的體液免疫水平,另外滅活疫苗也產(chǎn)生了較好的體液免疫水平。在細(xì)胞免疫方面,檢測(cè)了IFN-y的轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)水平,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,重組桿狀病毒疫苗誘導(dǎo)了較好的細(xì)胞免疫,滅活疫苗誘導(dǎo)的細(xì)胞免疫水平相對(duì)于重組桿狀病毒疫苗組則較低。 4鼠肺適應(yīng)甲型H1N1流感病毒株的制備和重組桿狀病毒BV-CMV-HA/M1/NA、BV-ie1-HA/Ml/NA在小鼠體內(nèi)誘發(fā)的保護(hù)性免疫 用乙醚將小鼠麻醉,將甲型H1N1流感病毒(A/wuhan/10/2010)在小鼠肺臟中傳代,使之成為能致死小鼠的鼠肺適應(yīng)甲型H1N1流感病毒株。 攻毒結(jié)果進(jìn)一步表明,重組桿狀病毒疫苗和滅活疫苗在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)均能有效抵抗致死劑量的甲型H1N1流感病毒的攻擊。為發(fā)展安全有效的甲型H1N1流感疫苗奠定了基礎(chǔ)。
[Abstract]:Influenza is an acute respiratory tract infections by disease, either for animal breeding or human health hazards caused by the severity of.2009 in April, in Mexico, have the swine H1N1 influenza outbreak in the United States and other countries, then quickly spread to the world in many countries and regions. In June of the same year, the WHO will the influenza pandemic alert level upgrade to 6. For such a large outbreak, vaccination is the most effective prevention and control of influenza, inactivated influenza virus vaccine is currently the most widely used for the prevention of influenza vaccine. Although the vaccine protection rate is better, but there are still some deficiencies, such as preparation a longer period, need a lot of chicken, a few individuals will have adverse reactions after vaccination. Therefore, researchers have been trying to develop a safer, more efficient flu vaccine.
Baculovirus has been used for the expression of exogenous proteins in insect cells. Recent studies show that, baculovirus vectors can transduce different types of mammalian cells and expression of exogenous gene in eukaryotic promoter driven by the same gene in different promoter under the control of its expression level will be very different. And by the vesicular stomatitis virus G protein (VSV/G) modified baculovirus, its host range, in mammalian cells, the transduction efficiency is higher.
In view of this, this study was to explore new influenza H1N1 genetic engineering vaccine, and constructs two kinds of promoter driven expression of recombinant baculovirus vaccine immunogenicity protein H1N1 influenza immunization, and immunogenicity evaluation of the vaccine in a mouse model, the main research contents are as follows:
1 construction of recombinant baculovirus BV-CMV-HA/M1/NA and BV-ie1-HA/M1/NA
White spot syndrome virus using (white spot syndrome virus, WSSV) of the IEL promoter and CMV promoter CMV were constructed with membrane surface display of recombinant VSV-G protein of baculovirus recombinant baculovirus driven two promoter are mediated by influenza a H1N1 influenza vaccine BV-CMV-HA/M1/NA and BV-ie1-HA/M1/NA.
More than 2 clone antibody preparation and recombinant baculovirus BV-CMV-HA/M1/NA, BV-ie1-HA/M1/NA expression in vitro
Based on the sequence of HA, primers were designed to amplify the HA subunit (tHA1), using genetic engineering methods to construct the prokaryotic expression plasmid pET28a-tHA1, the prokaryotic expression plasmid pET28a-tHA1 was transformed into E. coli BL21 (DE3) cells induced by IPTG recombinant protein expressed as inclusion bodies. The recombinant protein tHA1 SDS-PAGE electrophoresis, the target protein from the protein gel cutting, weighing, grinding with mortar to paste in the back of mice after multiple subcutaneous injection, injection quantity is 200uL. interval of two weeks, again the same way injection, a week after a second immunization, and weekly blood test antibody, and the antibody of mice to conform to requirements. A lot of blood serum was collected for mouse polyclonal antibody.
In order to confirm whether recombinant baculovirus can effectively express foreign protein in vivo, the recombinant baculovirus BV-CMV-HA/M1/NA and BV-ie1-HA/M1/NA were transduced into BHK-21 cells. IFA test showed that recombinant baculovirus BV-CMV-HA/M1/NA and BV-ie1-HA/M1/NA could express heterologous proteins in vitro.
Immunogenicity evaluation of 3 recombinant baculovirus BV-CMV-HA/Ml/NA and BV-iel-HA/Ml/NA in mice
In order to investigate the immune effect of recombinant baculovirus vaccine, with only 1 x 109PFU/ dose BLAB/c mice were immunized with H1N1 influenza virus inactivated vaccine as control. The results showed that: in the cell immunity, two recombinant baculovirus has good humoral immunity, also inactivated vaccine produces humoral immunity good level. On cell immunity, detection of the IFN-y transcription and protein expression levels, the experimental results show that the recombinant baculovirus vaccine induced immune cells effectively, destroy cellular immunity of vaccine induced with recombinant baculovirus vaccine group was lower.
Preparation of 4 mouse lung adapted to influenza A (H1N1) influenza virus strain and recombinant baculovirus BV-CMV-HA/M1/NA, protective immunity induced by BV-ie1-HA/Ml/NA in mice
The mice were anesthetized with ethyl ether, and the influenza A (H1N1) virus was subcultured in the lungs of mice, so that it could become a rat lung adapted to influenza A virus H1N1 in a lethal way in mice. The A/wuhan/10/2010 strain was able to adapt to influenza A virus.
The attack results further showed that the immune responses induced by recombinant baculovirus vaccine and inactivated vaccine in mice could effectively resist the attack of lethal dose of influenza A (H1N1) virus, which laid the foundation for developing a safe and effective influenza a H1N1 vaccine.

【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號(hào)】：R392.1;S855.3

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本文編號(hào)：1701755