本文選題：幽門螺桿菌　切入點：PGRN　出處：《山東大學》2011年博士論文

【摘要】：幽門螺桿菌(Helicobacter pylori, Hp)是慢性胃炎和消化性潰瘍的重要病因,與胃癌的發(fā)生密切相關,世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機構(IARC)已將幽門螺桿菌列為Ⅰ級致癌因子,然而幽門螺桿菌導致胃粘膜組織炎癥,以及持續(xù)性炎癥誘發(fā)惡性轉化的機制有待進一步研究。 Progranulin (PGRN),又稱為顆粒體蛋白前體,PC cell-derived growth factor, proepithelin, or acrogranin,屬于一類新型的生長因子,它在發(fā)育、細胞周期進展、細胞運動及腫瘤形成發(fā)展中起到重要的作用。PGRN在增生迅速的組織細胞中高表達,如皮膚、胃腸道及免疫細胞。近期研究顯示PGRN在腫瘤組織中也高表達,而且這種高表達可以顯著增強惡性腫瘤的播散。PGRN參與到促進腫瘤進展的多個環(huán)節(jié),包括細胞增殖、非錨定生長、侵襲性、抗凋亡及增強對細胞毒性藥物的抗性。因此PGRN所調控的細胞反應都可以促進細胞的惡性程度。 PGRN在炎癥過程中同樣發(fā)揮著重要的作用。在炎癥反應中,中性粒細胞趨化遷移并黏附到破損區(qū)域,脫顆粒,并最終在周圍釋放炎癥蛋白。PGRN在該過程中起到抑制炎癥的作用。在炎癥過程早期外源性PGRN干擾了TNFα所誘導的中性粒細胞內的信號通路。另外,與對照組相比,來源于PGRN缺陷小鼠的巨噬細胞受LPS刺激只能釋放少量的IL-10,卻產(chǎn)生較多的炎性因子。并且,PGRN缺陷小鼠不能有效清除李斯特菌的感染,從而細菌能夠在腦組織內增殖,并伴隨嚴重的炎癥反應。 然而,幽門螺桿菌感染與PGRN的關系及其PGRN在幽門螺桿菌感染所誘導的炎癥及其惡性轉化中的作用仍不清楚,我們對此進行了研究,取得了初步研究結果。 一、幽門螺桿菌對胃粘膜上皮細胞PGRN表達的影響及其在增殖和遷徙中的作用 腫瘤細胞的增殖和遷徙力是腫瘤轉移的重要步驟。幽門螺桿菌感染可以增強胃粘膜細胞的增殖速率并抑制凋亡,同時胃黏膜細胞的遷徙能力也增強,然而,其中的機制并未明確,由于PGRN促進腫瘤細胞的生長和遷徙轉移,為此我們研究了幽門螺桿菌對胃粘膜上皮細胞PGRN表達的影響及其在增殖、遷徙中的作用。 我們在分析正常胃粘膜組織、慢性胃炎和胃癌組織中PGRN的表達變化規(guī)律的基礎上,進一步研究幽門螺桿菌感染胃粘膜上皮細胞后如何引起PGRN表達的變化,以及PGRN在幽門螺桿菌感染后腫瘤進展中的作用。并明確幽門螺桿菌何種組分可以影響PGRN的表達及其相應的信號通路。為了研究幽門螺桿菌感染與胃粘膜上皮細胞PGRN的表達關系及其分子機制以及PGRN的表達變化在幽門螺桿菌感染促進細胞增殖和遷徙中的作用,我們在臨床標本及細胞系水平分析了幽門螺桿菌感染與胃粘膜上皮細胞PGRN表達的關系,并應用克隆形成實驗分析細胞增殖能力,劃痕實驗檢測細胞的遷徙能力。實驗證明,在臨床組織標本中,正常胃粘膜、淺表性胃炎、萎縮性胃炎及胃癌組織中PGRN的表達依次升高。幽門螺桿菌感染胃粘膜上皮細胞后可以明顯上調PGRN的表達,并具有時間依賴性,為了防止該現(xiàn)象具有菌株特異性,多株幽門螺桿菌感染胃粘膜上皮細胞后均得到一致的結果。作為幽門螺桿菌的主要致病因子CagA、VacA、LPS等并不參與調控PGRN,只有活菌完整的接觸胃粘膜上皮細胞才能影響PGRN的表達。幽門螺桿菌感染可以活化p38、MEK1/2途徑,但應用信號抑制劑阻斷p38、MEK1/2途徑后,幽門螺桿菌感染則不影響PGRN的表達。而在胃粘膜上皮細胞中干擾PGRN后可以明顯減弱幽門螺桿菌所促進的胃癌細胞增殖和遷徙的能力。通過以上實驗可得到如下結論：(1)PGRN在慢性胃炎、胃癌患者的胃組織中表達顯著升高；(2)幽門螺桿菌感染胃粘膜上皮細胞后PGRN mRNA和蛋白水平均明顯增高：(3)幽門螺桿菌感染胃粘膜上皮細胞上調PGRN不依賴于CagA、VacA、LPS等,只有活菌完整的接觸胃粘膜上皮細胞才能影響PGRN的表達；(4)幽門螺桿菌感染誘導PGRN表達依賴于p38、MEK1/2信號途徑；(5)PGRN參與幽門螺桿菌所促進的胃癌細胞的增殖和遷徙。 二、PGRN抑制幽門螺桿菌誘導胃粘膜上皮細胞COX-2的表達 幽門螺桿菌是胃部、十二指腸炎癥中重要的致病菌。在幽門螺桿菌毒力因子的作用下,多種炎性介質包括細胞因子和誘導型的酶都在胃粘膜組織表達增高。其中一些介質可以損傷胃粘膜,如COX-2,另外一些則可以調控宿主的免疫反應和維持胃粘膜的完整性,如PGRN。 環(huán)加氧酶(Cyclooxygenase)能催化花生四烯酸形成前列腺素類和血栓烷類,有兩種亞型,COX-1和COX-2。COX-1在胃粘膜組織和大多數(shù)組織器官中構成性表達,維持細胞內環(huán)境,作為一種持家酶,正常表達生理條件下可以維持胃粘膜的完整性。相反,而COX-2在正常組織中檢測不到,但是炎性因子、脂多糖、有絲分裂原和活性氧刺激胃粘膜上皮細胞后可以穩(wěn)定表達。幽門螺桿菌感染所引起的慢性炎癥COX-2表達增高,這與慢性炎癥細胞的侵潤程度有關。COX-2刺激所產(chǎn)生的前列腺素能夠促進炎癥進程。幽門螺桿菌感染胃粘膜上皮后,PGE2誘導IL-8的產(chǎn)生,而該過程在用EP2和EP4拮抗劑預處理后受到抑制。胃粘膜組織COX-2的表達與幽門螺桿菌感染胃粘膜組織后多形核白細胞和單核細胞的侵潤呈正向關系。既然胃粘膜炎癥和損傷的嚴重性與COX-2等基因表達和蛋白水平有關,抑制該炎性酶的表達對于治療與幽門螺桿菌相關性胃部疾病應該是有益的。所以,幽門螺桿菌感染所誘導的COX-2有可能是幽門螺桿菌感染引起胃炎和粘膜損傷的重要機制。 炎性基因的表達主要是轉錄因子所調控,COX-2基因啟動子區(qū)有nuclear factor-κB(NF-κB)的結合位點,而幽門螺桿菌能夠活化NF-κB。NF-κB屬于Rel家族,包括p50,p52,p65,c-Rel, Rel B等。在靜止期細胞,NF-κB位于胞漿內,可以與胞漿內抑制性蛋白非共價結合,如IκB-a。致病性誘導物如病毒、有絲分裂原、細菌、炎性刺激因子等刺激后, NF-κB轉移到核內,結合到DNA識別位點,調控下游靶基因的轉錄。而NF-κB在幽門螺桿菌通過上調COX-2誘導胃炎過程中發(fā)揮著重要的作用。 為了研究幽門螺桿菌感染對胃粘膜上皮細胞PGRN對COX-2表達的影響及其機制,幽門螺桿菌感染C57BL/6小鼠48周,運用HE染色和免疫組化技術檢測胃粘膜組織炎癥、以及COX-2和PGRN的表達狀況；運用幽門螺桿菌感染的胃粘膜上皮細胞分別轉染PGRN-siRNA、pcDNA3.1PGRN以及它們相應的對照。COX-2蛋白的表達、Iκbα的磷酸化通過Western blotting檢測；免疫熒光檢測NFκB P65的核轉位。幽門螺桿菌感染感染小鼠胃粘膜組織中性粒細胞、嗜酸性粒細胞侵潤,COX-2和PGRN的表達水平明顯升高；細胞系水平也得到一致的結果并具有時間依賴性。胃粘膜上皮細胞過表達PGRN后能夠抑制COX-2蛋白的表達、Iκbα的磷酸化以及NF-κB P65核轉位。然而,運用RNAi技術抑制PGRN在胃粘膜上皮細胞的表達后再感染幽門螺桿菌,COX-2蛋白的表達、以及NFκB P65核轉位卻均升高。因此,PGRN是一個重要的炎癥調節(jié)因子,通過抑制COX-2的表達發(fā)揮的抗炎作用。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2011
【分類號】：R378.99

【共引文獻】

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本文編號：1700519