本文選題：幽門螺桿菌　切入點(diǎn)：PGRN　出處：《山東大學(xué)》2011年博士論文

【摘要】：幽門螺桿菌(Helicobacter pylori, Hp)是慢性胃炎和消化性潰瘍的重要病因,與胃癌的發(fā)生密切相關(guān),世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機(jī)構(gòu)(IARC)已將幽門螺桿菌列為Ⅰ級(jí)致癌因子,然而幽門螺桿菌導(dǎo)致胃粘膜組織炎癥,以及持續(xù)性炎癥誘發(fā)惡性轉(zhuǎn)化的機(jī)制有待進(jìn)一步研究。 Progranulin (PGRN),又稱為顆粒體蛋白前體,PC cell-derived growth factor, proepithelin, or acrogranin,屬于一類新型的生長因子,它在發(fā)育、細(xì)胞周期進(jìn)展、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)及腫瘤形成發(fā)展中起到重要的作用。PGRN在增生迅速的組織細(xì)胞中高表達(dá),如皮膚、胃腸道及免疫細(xì)胞。近期研究顯示PGRN在腫瘤組織中也高表達(dá),而且這種高表達(dá)可以顯著增強(qiáng)惡性腫瘤的播散。PGRN參與到促進(jìn)腫瘤進(jìn)展的多個(gè)環(huán)節(jié),包括細(xì)胞增殖、非錨定生長、侵襲性、抗凋亡及增強(qiáng)對(duì)細(xì)胞毒性藥物的抗性。因此PGRN所調(diào)控的細(xì)胞反應(yīng)都可以促進(jìn)細(xì)胞的惡性程度。 PGRN在炎癥過程中同樣發(fā)揮著重要的作用。在炎癥反應(yīng)中,中性粒細(xì)胞趨化遷移并黏附到破損區(qū)域,脫顆粒,并最終在周圍釋放炎癥蛋白。PGRN在該過程中起到抑制炎癥的作用。在炎癥過程早期外源性PGRN干擾了TNFα所誘導(dǎo)的中性粒細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)通路。另外,與對(duì)照組相比,來源于PGRN缺陷小鼠的巨噬細(xì)胞受LPS刺激只能釋放少量的IL-10,卻產(chǎn)生較多的炎性因子。并且,PGRN缺陷小鼠不能有效清除李斯特菌的感染,從而細(xì)菌能夠在腦組織內(nèi)增殖,并伴隨嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)。 然而,幽門螺桿菌感染與PGRN的關(guān)系及其PGRN在幽門螺桿菌感染所誘導(dǎo)的炎癥及其惡性轉(zhuǎn)化中的作用仍不清楚,我們對(duì)此進(jìn)行了研究,取得了初步研究結(jié)果。 一、幽門螺桿菌對(duì)胃粘膜上皮細(xì)胞PGRN表達(dá)的影響及其在增殖和遷徙中的作用 腫瘤細(xì)胞的增殖和遷徙力是腫瘤轉(zhuǎn)移的重要步驟。幽門螺桿菌感染可以增強(qiáng)胃粘膜細(xì)胞的增殖速率并抑制凋亡,同時(shí)胃黏膜細(xì)胞的遷徙能力也增強(qiáng),然而,其中的機(jī)制并未明確,由于PGRN促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長和遷徙轉(zhuǎn)移,為此我們研究了幽門螺桿菌對(duì)胃粘膜上皮細(xì)胞PGRN表達(dá)的影響及其在增殖、遷徙中的作用。 我們?cè)诜治稣Ｎ刚衬そM織、慢性胃炎和胃癌組織中PGRN的表達(dá)變化規(guī)律的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步研究幽門螺桿菌感染胃粘膜上皮細(xì)胞后如何引起PGRN表達(dá)的變化,以及PGRN在幽門螺桿菌感染后腫瘤進(jìn)展中的作用。并明確幽門螺桿菌何種組分可以影響PGRN的表達(dá)及其相應(yīng)的信號(hào)通路。為了研究幽門螺桿菌感染與胃粘膜上皮細(xì)胞PGRN的表達(dá)關(guān)系及其分子機(jī)制以及PGRN的表達(dá)變化在幽門螺桿菌感染促進(jìn)細(xì)胞增殖和遷徙中的作用,我們?cè)谂R床標(biāo)本及細(xì)胞系水平分析了幽門螺桿菌感染與胃粘膜上皮細(xì)胞PGRN表達(dá)的關(guān)系,并應(yīng)用克隆形成實(shí)驗(yàn)分析細(xì)胞增殖能力,劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的遷徙能力。實(shí)驗(yàn)證明,在臨床組織標(biāo)本中,正常胃粘膜、淺表性胃炎、萎縮性胃炎及胃癌組織中PGRN的表達(dá)依次升高。幽門螺桿菌感染胃粘膜上皮細(xì)胞后可以明顯上調(diào)PGRN的表達(dá),并具有時(shí)間依賴性,為了防止該現(xiàn)象具有菌株特異性,多株幽門螺桿菌感染胃粘膜上皮細(xì)胞后均得到一致的結(jié)果。作為幽門螺桿菌的主要致病因子CagA、VacA、LPS等并不參與調(diào)控PGRN,只有活菌完整的接觸胃粘膜上皮細(xì)胞才能影響PGRN的表達(dá)。幽門螺桿菌感染可以活化p38、MEK1/2途徑,但應(yīng)用信號(hào)抑制劑阻斷p38、MEK1/2途徑后,幽門螺桿菌感染則不影響PGRN的表達(dá)。而在胃粘膜上皮細(xì)胞中干擾PGRN后可以明顯減弱幽門螺桿菌所促進(jìn)的胃癌細(xì)胞增殖和遷徙的能力。通過以上實(shí)驗(yàn)可得到如下結(jié)論：(1)PGRN在慢性胃炎、胃癌患者的胃組織中表達(dá)顯著升高；(2)幽門螺桿菌感染胃粘膜上皮細(xì)胞后PGRN mRNA和蛋白水平均明顯增高：(3)幽門螺桿菌感染胃粘膜上皮細(xì)胞上調(diào)PGRN不依賴于CagA、VacA、LPS等,只有活菌完整的接觸胃粘膜上皮細(xì)胞才能影響PGRN的表達(dá)；(4)幽門螺桿菌感染誘導(dǎo)PGRN表達(dá)依賴于p38、MEK1/2信號(hào)途徑；(5)PGRN參與幽門螺桿菌所促進(jìn)的胃癌細(xì)胞的增殖和遷徙。 二、PGRN抑制幽門螺桿菌誘導(dǎo)胃粘膜上皮細(xì)胞COX-2的表達(dá) 幽門螺桿菌是胃部、十二指腸炎癥中重要的致病菌。在幽門螺桿菌毒力因子的作用下,多種炎性介質(zhì)包括細(xì)胞因子和誘導(dǎo)型的酶都在胃粘膜組織表達(dá)增高。其中一些介質(zhì)可以損傷胃粘膜,如COX-2,另外一些則可以調(diào)控宿主的免疫反應(yīng)和維持胃粘膜的完整性,如PGRN。 環(huán)加氧酶(Cyclooxygenase)能催化花生四烯酸形成前列腺素類和血栓烷類,有兩種亞型,COX-1和COX-2。COX-1在胃粘膜組織和大多數(shù)組織器官中構(gòu)成性表達(dá),維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境,作為一種持家酶,正常表達(dá)生理?xiàng)l件下可以維持胃粘膜的完整性。相反,而COX-2在正常組織中檢測(cè)不到,但是炎性因子、脂多糖、有絲分裂原和活性氧刺激胃粘膜上皮細(xì)胞后可以穩(wěn)定表達(dá)。幽門螺桿菌感染所引起的慢性炎癥COX-2表達(dá)增高,這與慢性炎癥細(xì)胞的侵潤程度有關(guān)。COX-2刺激所產(chǎn)生的前列腺素能夠促進(jìn)炎癥進(jìn)程。幽門螺桿菌感染胃粘膜上皮后,PGE2誘導(dǎo)IL-8的產(chǎn)生,而該過程在用EP2和EP4拮抗劑預(yù)處理后受到抑制。胃粘膜組織COX-2的表達(dá)與幽門螺桿菌感染胃粘膜組織后多形核白細(xì)胞和單核細(xì)胞的侵潤呈正向關(guān)系。既然胃粘膜炎癥和損傷的嚴(yán)重性與COX-2等基因表達(dá)和蛋白水平有關(guān),抑制該炎性酶的表達(dá)對(duì)于治療與幽門螺桿菌相關(guān)性胃部疾病應(yīng)該是有益的。所以,幽門螺桿菌感染所誘導(dǎo)的COX-2有可能是幽門螺桿菌感染引起胃炎和粘膜損傷的重要機(jī)制。 炎性基因的表達(dá)主要是轉(zhuǎn)錄因子所調(diào)控,COX-2基因啟動(dòng)子區(qū)有nuclear factor-κB(NF-κB)的結(jié)合位點(diǎn),而幽門螺桿菌能夠活化NF-κB。NF-κB屬于Rel家族,包括p50,p52,p65,c-Rel, Rel B等。在靜止期細(xì)胞,NF-κB位于胞漿內(nèi),可以與胞漿內(nèi)抑制性蛋白非共價(jià)結(jié)合,如IκB-a。致病性誘導(dǎo)物如病毒、有絲分裂原、細(xì)菌、炎性刺激因子等刺激后, NF-κB轉(zhuǎn)移到核內(nèi),結(jié)合到DNA識(shí)別位點(diǎn),調(diào)控下游靶基因的轉(zhuǎn)錄。而NF-κB在幽門螺桿菌通過上調(diào)COX-2誘導(dǎo)胃炎過程中發(fā)揮著重要的作用。 為了研究幽門螺桿菌感染對(duì)胃粘膜上皮細(xì)胞PGRN對(duì)COX-2表達(dá)的影響及其機(jī)制,幽門螺桿菌感染C57BL/6小鼠48周,運(yùn)用HE染色和免疫組化技術(shù)檢測(cè)胃粘膜組織炎癥、以及COX-2和PGRN的表達(dá)狀況；運(yùn)用幽門螺桿菌感染的胃粘膜上皮細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染PGRN-siRNA、pcDNA3.1PGRN以及它們相應(yīng)的對(duì)照。COX-2蛋白的表達(dá)、Iκbα的磷酸化通過Western blotting檢測(cè)；免疫熒光檢測(cè)NFκB P65的核轉(zhuǎn)位。幽門螺桿菌感染感染小鼠胃粘膜組織中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞侵潤,COX-2和PGRN的表達(dá)水平明顯升高；細(xì)胞系水平也得到一致的結(jié)果并具有時(shí)間依賴性。胃粘膜上皮細(xì)胞過表達(dá)PGRN后能夠抑制COX-2蛋白的表達(dá)、Iκbα的磷酸化以及NF-κB P65核轉(zhuǎn)位。然而,運(yùn)用RNAi技術(shù)抑制PGRN在胃粘膜上皮細(xì)胞的表達(dá)后再感染幽門螺桿菌,COX-2蛋白的表達(dá)、以及NFκB P65核轉(zhuǎn)位卻均升高。因此,PGRN是一個(gè)重要的炎癥調(diào)節(jié)因子,通過抑制COX-2的表達(dá)發(fā)揮的抗炎作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號(hào)】：R378.99

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1700519