本文選題：紫杉醇　切入點：單克隆抗體　出處：《南方醫(yī)科大學(xué)》2012年碩士論文

【摘要】：1975年兩位生物分子學(xué)家Kohler和Milstein利用經(jīng)過免疫的小鼠脾細胞和骨髓瘤細胞融合,建立了能分泌針對特定抗原產(chǎn)生抗體的雜交瘤細胞株,標志著單克隆抗體技術(shù)的誕生。所謂單克隆抗體(簡稱單抗),是指由單個B細胞克隆化所分泌的只識別一個抗原決定簇的完全均一抗體。單克隆抗體的問世,既帶動了免疫學(xué)領(lǐng)域的一次革命,又對生物醫(yī)學(xué)等多種學(xué)科的發(fā)展產(chǎn)生了重大影響。 技術(shù)單克隆抗體的制備方法分為雜交瘤技術(shù)和基因工程技術(shù)。雜交瘤技術(shù)是目前使用最廣泛的抗體制備方式,該法主要包括動物免疫、細胞融合、雜交瘤細胞篩選三個環(huán)節(jié),制備出的抗體具有高親和力、高靈敏度、可大規(guī)模成產(chǎn)等優(yōu)點,廣泛用于物質(zhì)的檢測、分離工作。基因工程抗體技術(shù)種類很多,包括嵌合抗體技術(shù)、重構(gòu)抗體技術(shù)、噬菌體展示技術(shù)、核糖體展示技術(shù)、基因工程小鼠制備抗體技術(shù)等。 隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展,單抗已經(jīng)在眾多領(lǐng)域中得到了應(yīng)用。單抗應(yīng)用最多的領(lǐng)域是臨床疾病的診斷,其在淋巴細胞鑒別、病原體鑒定、寄生蟲檢測、腫瘤診斷和分型、激素檢測方面有著獨特優(yōu)勢。人源化單抗可用于臨床治療,其在自身免疫性疾病、心血管疾病、癌癥等疾病的治療上得到了廣泛應(yīng)用。此外,單抗還可應(yīng)用于食品中有害物質(zhì)的檢測,生藥研究中的小分子活性成分的檢測、分離、純化及與毒性物質(zhì)的中和。 免疫分析法是單克隆抗體應(yīng)用中一項非常重要的領(lǐng)域。它是基于抗原與抗體的特異性反應(yīng),同時采取酶或其他有色或發(fā)光物質(zhì)標記抗原或抗體從而進行定性或定量檢測,其特異性和靈敏度要遠高于一般的理化方法。目前應(yīng)用較多的免疫分析法是酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA),包含雙抗夾心法、間接法、競爭法三種常用的方法。它具有特異性強、靈敏度高、操作簡便、樣品前處理要求低、檢測迅速高效、無環(huán)境污染、設(shè)備投入低等優(yōu)點,適合推廣應(yīng)用。 生藥活性物質(zhì)一般屬于半抗原,需要在半抗原上偶聯(lián)特定的大分子物質(zhì)作為載體才能構(gòu)成完全抗原,刺激機體發(fā)生特異性免疫應(yīng)答,產(chǎn)生特異性抗體。與半抗原偶聯(lián)的載體一般為蛋白質(zhì),如牛血清蛋白(BSA)、兔血清白蛋白(RSA)、雞卵清蛋白(OVA)、人血清白蛋白(HSA)、鑰匙孔戚血藍蛋白(KLH),也有其他大分子物質(zhì),如多聚賴氨酸(PLL)。 紫杉醇是從紅豆杉屬植物中分離出來的一種三環(huán)二萜化合物,具有獨特的誘導(dǎo)微管蛋白聚合而抑制細胞分裂的抗腫瘤機制。紫杉醇在1992年被美國食品與藥物管理局(FAD)批準作為抗晚期癌癥的新藥上市,到目前為止仍然是治療乳腺癌、子宮癌、卵巢癌等癌癥的臨床一線用藥。由于紫杉醇的市場需求量不斷增大,其成產(chǎn)的主要原料紅豆杉又屬于稀缺資源,再加上它在植物中的含量極低,因此紫杉醇醫(yī)療價值和研究價值有著很大的上升潛力。 準確高效的檢測方法是紫杉醇研究中必不可少的。當前用于紫杉醇檢測的方法有薄層色譜法、毛細管電泳法、高效液相色譜法、超臨界流體色譜法,質(zhì)譜法,生物化學(xué)方法,其中應(yīng)用最廣泛的方法是高效液相色譜法。這些方法盡管有些具有某方面的優(yōu)勢,但總體上存在著設(shè)備投入高、操作復(fù)雜、樣品前處理復(fù)雜、時間消耗長等缺點,而免疫檢測技術(shù)在許多天然藥物的質(zhì)量控制中已經(jīng)得到了應(yīng)用,并顯示出其靈敏度高,設(shè)備投入低,方便快捷等方面的優(yōu)勢,因此,本研究嘗試利用免疫檢測技術(shù)用于紫杉醇物質(zhì)的檢測。 本研究報道的是一種紫杉醇單克隆抗體的制備及應(yīng)用該單抗建立用于紫杉醇檢測的間接競爭ELISA方法。該方法適合用于有關(guān)紫杉醇的質(zhì)量控制和若干研究,且在某些方面優(yōu)于以往報道的紫杉醇免疫檢測法。 紫杉醇是小分子物質(zhì)(Mr=853.93),屬于半抗原,并且由于紫杉醇分子上缺少能與載體蛋白結(jié)合的基團,我們采用7-木糖基紫杉醇與牛血清白蛋白(BSA)合成抗原復(fù)合物,利用基質(zhì)輔助激光飛行時間質(zhì)譜法(MALDI-TOF MS)檢測木糖基紫杉醇-BSA抗原復(fù)合物中半抗原的數(shù)目。用此抗原復(fù)合物對2只BALB/c雌性小鼠進行免疫,免疫過程中對小鼠的抗血清進行效價測定與抗體特異性測定。選擇抗血清效價較高的免疫小鼠,取其脾臟細胞與SP2/0瘤細胞株融合,使用有限稀釋法篩選陽性雜交瘤細胞系,通過小鼠腹腔接種法進行單克隆抗體的大量生產(chǎn),利用鹽析法結(jié)合proteinG層析柱純化抗體。獲得的單抗命名為3A3,該抗體類型為IgG1并且?guī)в蠯輕鏈,對紫杉醇有很強的親和力,與其他天然的紫杉烷類交叉反應(yīng)分別為：7-木糖基紫杉醇,31.8%；三尖杉寧堿,6.17%；巴卡亭Ⅲ、10-脫乙酰巴卡亭Ⅲ、1-羥基巴卡亭Ⅰ、13-乙酰-9-氫巴卡亭Ⅲ和1-乙酰氧基-5-去乙�；�-巴卡亭I,0.11%)。使用該抗體建立了用于紫杉醇檢測的間接競爭ELISA,檢測限是0.0098-0.3125μg/mL,并將此法應(yīng)用于紅豆杉的樹皮、根、枝葉樣品的檢測。紅豆杉樣品檢測方法的回收率是92%-94.8%,板內(nèi)和板間檢測的變異分別是3.6%和4.7%,該間接競爭ELISA為多種不同目的的紫杉醇檢測提供了一個很有價值的方法。 我們建立的用于檢測紫杉醇的間接競爭ELISA比HPLC更具有實用性,即不需要高端儀器,在常規(guī)實驗室條件下就可操作。使用該方法可同時檢測多個樣本,且樣品不需要復(fù)雜前處理,有機溶劑使用極少,顯示出了其低成本、高效率、操作簡便性、環(huán)保等方面的優(yōu)勢。 制備紫杉醇免疫復(fù)合物采用的紫杉醇衍生物是7-木糖基紫杉醇,這比以往報道的方法要簡單得多,因為7-木糖基紫杉醇是天然的紫杉醇衍生物,可直接從市場購買,省去了紫杉醇衍生物合成過程,使得紫杉醇完全抗原合成程序更加方便快捷。 從本研究獲得的單抗3A3與缺少C-13側(cè)鏈的巴卡亭類紫杉烷無交叉反應(yīng),從該交叉反應(yīng)特性來看,推測單抗的抗原決定簇位于C-13側(cè)鏈的遠側(cè)。這在一定程度上解決了現(xiàn)有紫杉醇免疫檢測方法中的缺陷。 該免疫檢測法能應(yīng)用于紫杉醇藥物的大批量快速檢測、監(jiān)測體液中紫杉醇的代謝、檢測極低紫杉醇含量的樣品、尋找能產(chǎn)生紫杉醇的新資源等多方面的工作。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號】：R392

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 宋建武;晁志;董為人;;石杉堿甲人工抗原的合成、鑒定及免疫原性分析[J];第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報;2009年21期

2 馬麗玲;譚銘銘;晁志;;用ELISA法檢驗柴胡藥材的質(zhì)量[J];南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報;2011年06期

3 朱學(xué)泰,謝溱,馬瑞君;單克隆抗體制備技術(shù)研究進展[J];甘肅科技;2005年03期

4 李金明;小分子物質(zhì)酶免疫測定方法的研究進展[J];國外醫(yī)學(xué).臨床生物化學(xué)與檢驗學(xué)分冊;1995年02期

5 趙寧;徐飛;吳小平;王戰(zhàn)輝;李杰超;朱景慧;潘凈茹;;ELISA一步法快速檢測牛奶中三聚氰胺的研究[J];中國畜牧獸醫(yī);2011年04期

6 劉瑞振;張長弓;何瓊;蘇金華;陳彩霞;陳福;莊國洪;;抗人DcR3單克隆抗體的制備、鑒定及應(yīng)用[J];免疫學(xué)雜志;2009年01期

7 唐波;劉曉;徐曉昱;姚其正;鄭偉娟;華子春;;雷公藤內(nèi)酯醇人工抗原的合成及多克隆抗體的制備[J];東南大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版);2008年06期

8 郭旭;劉吉華;余伯陽;;中藥中活性物質(zhì)單克隆抗體的制備及其免疫檢測應(yīng)用[J];南京曉莊學(xué)院學(xué)報;2010年03期

9 陳亮;陳婷;徐強;;免疫親和色譜特異性剔除中藥方劑四逆散中的柚皮苷[J];色譜;2006年03期

10 徐曉健;宋長征;;紫杉醇免疫檢測方法的研究進展[J];生物學(xué)雜志;2009年04期

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前3條

1 王志剛;曼地亞紅豆杉中紫杉醇的提取分離工藝及測定研究[D];中南大學(xué);2007年

2 蔡碧雙;中藥活性成分甘草酸的單克隆抗體制備及其免疫測定法的建立[D];廈門大學(xué);2008年

3 林紀昀;復(fù)方中藥內(nèi)兩種主要活性成分的單克隆抗體測定法的建立[D];廈門大學(xué);2008年

，

本文編號：1696274