本文選題：T細(xì)胞免疫球蛋白粘蛋白　切入點：重組質(zhì)粒　出處：《第二軍醫(yī)大學(xué)》2011年博士論文

【摘要】：CD4~＋T輔助細(xì)胞的活化、增殖和分化是抗原特異性免疫反應(yīng)產(chǎn)生的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。該反應(yīng)的產(chǎn)生除了需要抗原遞呈細(xì)胞（Antigen presenting cells, APCs）提供抗原肽MHC復(fù)合物與T細(xì)胞受體特異性結(jié)合外，還必須有APCs提供協(xié)同刺激分子如免疫球蛋白家族成員（CD80、ICOSL等）、TNF家族成員（CD40、OX40、4-1BB、CD27、LIGHT等）和多種細(xì)胞因子的參與。隨著研究的深入，不斷有新的分子被發(fā)現(xiàn)參與、調(diào)控了T細(xì)胞的活化過程。因此，T細(xì)胞的活化與調(diào)節(jié)仍然是基礎(chǔ)免疫學(xué)研究的重點，也是移植免疫學(xué)關(guān)注的熱點。 T細(xì)胞免疫球蛋白粘蛋白（T cell immunoglobulin mucin，Tim）是2001年發(fā)現(xiàn)的表達(dá)在T細(xì)胞和DCs表面與細(xì)胞活化相關(guān)的新分子。小鼠TIM基因家族位于11B1.1，目前共發(fā)現(xiàn)8個基因，編碼蛋白Tim-l～4和4個假想蛋白Tim-5～8。人類TIM基因家族只有3個成員，定位于染色體5q33.2，分別編碼蛋白Tim-l, 3, 4（沒有Tim-2）。Tim是一類具有共同基序的跨膜糖蛋白，其結(jié)構(gòu)包括免疫球蛋白（Ig）樣區(qū)、粘蛋白樣區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)。除Tim-4外，Tim-1，2，3的胞內(nèi)區(qū)均含有酪氨酸激酶磷酸化位點，直接參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。 早期研究發(fā)現(xiàn)，，Tim-1表達(dá)于所有活化的CD4~+ T細(xì)胞，并在其分化后仍高表達(dá)于Th2細(xì)胞，而低表達(dá)于Th1，Th17，CD11c~+骨髓源性樹突狀細(xì)胞（Dendritic cells,DCs）和CD19~+ B細(xì)胞。Tim-1的配體為Tim-4，與其它Tim蛋白不同，小鼠Tim-4只表達(dá)于APCs。它作為Tim-1的配體參與T細(xì)胞的活化和增殖，并能減少其凋亡。Tim-主要表達(dá)于Th1細(xì)胞和DCs，它與DCs上的Galectin-9結(jié)合后能導(dǎo)致Th1細(xì)胞的凋亡。 然而，隨著研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)Tim-1和Tim-4在免疫調(diào)節(jié)中的作用比預(yù)想的更為復(fù)雜。最近的研究顯示，小鼠Tim-4與人IgG_1 Fc段融合蛋白（Tim-4-Ig）在不同的終濃度下能刺激或抑制培養(yǎng)體系中T細(xì)胞的活化。另外, Tim-4-Ig可以通過與小鼠初始CD4~+ T細(xì)胞上的某種配體結(jié)合抑制其活化，經(jīng)證實，這種配體并非Tim-1。然而，Tim-4-Ig的這種作用只局限于不表達(dá)Tim-1的小鼠初始T細(xì)胞，它不能抑制預(yù)先激活的T細(xì)胞增殖。上述研究提示Tim-4-Ig可以與T細(xì)胞上的不同配體結(jié)合，介導(dǎo)不同的免疫效應(yīng)。此外，Tim-1的不同單克隆抗體（3B3和RMT1-10）也可以對T細(xì)胞活化產(chǎn)生相反的作用，這可能取決于它們與Tim-1結(jié)合的親和力不同或?qū)?xì)胞骨架結(jié)構(gòu)的影響不同。因此，進(jìn)一步闡明Tim-1調(diào)節(jié)T細(xì)胞反應(yīng)的機(jī)制，對于開發(fā)治療自身免疫性疾病和移植物排斥反應(yīng)的新藥物，具有重要的意義。 基于上述研究，本課題擬進(jìn)一步：（1）合成人源化Tim-1胞外段和IgG_1 Fc段融合蛋白（Tim-1-Fc），檢測其與小鼠不同種類細(xì)胞的結(jié)合情況，驗證其是否具有交叉活性，并判定這種可能的結(jié)合是否是Tim-4依賴性的；（2）體外研究Tim-1-Fc對anti-CD3, anti-CD28 mAbs介導(dǎo)的小鼠CD4~+ T細(xì)胞活化，增殖，凋亡，細(xì)胞周期和對同種DCs介導(dǎo)的混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)（Allogeneic mixed lymphocyte response, allo-MLR）的影響，探討其胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑；觀察其對調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Regulatory T cells, Tregs）增殖和叉頭狀轉(zhuǎn)錄因子p3（Forkhead transcription factor p3, Foxp3）表達(dá)的影響；（3）通過腹腔注射Tim-1-Fc（對照組注射PBS和人IgG_1），阻斷Tim-4-Tim-1介導(dǎo)的T細(xì)胞活化，觀察其對小鼠頸部異位心臟移植物生存期的影響，初步揭示其抑制移植排斥反應(yīng)的作用和體內(nèi)機(jī)制；通過本課題研究，有望進(jìn)一步認(rèn)識Tim-1-Fc分子在T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)和抑制同種移植物排斥反應(yīng)中的作用，為尋找臨床免疫抑制治療的新靶點提供實驗依據(jù)。 目的：合成人源化Tim-1胞外段和IgG_1 Fc段融合蛋白（Tim-1-Fc），檢測其與小鼠不同細(xì)胞結(jié)合情況，驗證其是否具有交叉活性，并判定這種可能的結(jié)合是否是Tim-4依賴性的。方法：從基因庫中搜索人Tim-1胞外段和IgG_1 Fc段的cDNA序列，克隆到哺乳動物細(xì)胞表達(dá)載體pcDNA3.1上，利用轉(zhuǎn)染試劑將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入中國倉鼠卵巢細(xì)胞（Chinese hamster ovary, CHO）中，通過Western-blot檢測Tim-1-Fc表達(dá)情況，經(jīng)親和、離子交換等多種層析方法純化蛋白。采用流式細(xì)胞儀（Flow cytometry, FCM）檢測Tim-1-Fc與未接受刺激的或刺激3天后的小鼠DCs，CD4~+CD25~- T細(xì)胞，CD4~+CD25~+ T細(xì)胞（Natural regulatory T cells, nTregs）結(jié)合情況，加入Tim-4單抗，阻斷可能的Tim-4-Tim-1-Fc結(jié)合。結(jié)果：經(jīng)Western-blot檢測，合成的Tim-1-Fc分子量約62KD，純度92%。Tim-1-Fc不結(jié)合DCs，nTregs和未活化的CD4~+CD25~- T細(xì)胞，但能選擇性結(jié)合活化后的CD4~+CD25~- T細(xì)胞（Effector T cells, Teffs），且該作用不被anti-Tim-4 mAb阻斷。結(jié)論：Tim-1-Fc構(gòu)建成功。小鼠Teffs上存在人Tim-1的新型配體。 目的：觀察Tim-1-Fc在體外對CD4~+ T細(xì)胞活化，增殖，凋亡和細(xì)胞周期，胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，allo-MLR以及nTregs增殖、Fxop3表達(dá)的影響。方法：在CD4~+ T細(xì)胞培養(yǎng)體系中加入不同終濃度的Tim-1-Fc（1，5，10μg/ml），按不同比例（1:40，1:20，1:10）將DC與CD4~+ T細(xì)胞混合培養(yǎng)，采用3H摻入法檢測細(xì)胞增殖，CSFE檢測細(xì)胞分裂，ELISA檢測培養(yǎng)上清液中Th1/Th2細(xì)胞因子分泌情況，PI/Annexin V雙染色法檢測各組CD4~+ T細(xì)胞凋亡的比例，RT-PCR法檢測Tim-1-Fc對nTregs內(nèi)Foxp3基因轉(zhuǎn)錄的影響，Western-blot檢測Tim-1-Fc對細(xì)胞周期蛋白Cdk2，Cdk4，p27~(kip)表達(dá)及anti-CD3（2μg/ml）, anti-CD28（1μg/ml）mAbs刺激后不同時間點（5, 15, 30min）CD4~+ T細(xì)胞內(nèi)信號分子AKT，ERK1/2磷酸化情況的影響。結(jié)果：Tim-1-Fc不但能抑制CD4~+ T細(xì)胞表面活化標(biāo)志CD25，CD69表達(dá)、抑制細(xì)胞分裂增殖，該作用不依賴于Tim-4（RT-PCR和FCM檢測也未發(fā)現(xiàn)小鼠T細(xì)胞表達(dá)Tim-4）；還能顯著下調(diào)Cdk2，Cdk4而增加p27~(kip)表達(dá)，使細(xì)胞停滯在G1期；抑制CD4~+ T細(xì)胞內(nèi)AKT，ERK1/2磷酸化；抑制allo-MLR，誘導(dǎo)T細(xì)胞對同種抗原的低反應(yīng)性，減少IL-2，IFN-γ而促進(jìn)IL-10的分泌。但Tim-1-Fc對CD4~+ T細(xì)胞凋亡，nTregs增殖和Foxp3表達(dá)無明顯影響。結(jié)論：Tim-1-Fc在體外能通過與T細(xì)胞表面新型受體結(jié)合抑制CD4~+ T細(xì)胞活化、增殖和Th1源性細(xì)胞因子表達(dá)，使細(xì)胞停滯在G_0/G_1期，并下調(diào)T細(xì)胞內(nèi)信號分子AKT，ERK1/2磷酸化水平。還能抑制小鼠allo-MLR，誘導(dǎo)T細(xì)胞對同種抗原的低反應(yīng)性；但它不影響CD4~+ T細(xì)胞凋亡，nTregs增殖和Foxp3表達(dá)。 目的：觀察Tim-1-Fc對小鼠心臟移植物存活期的影響并探討其抑制排斥反應(yīng)的體內(nèi)機(jī)制。方法：采用BALB/c→C57BL/6小鼠頸部異位心臟移植模型，將受體分為3組（每組n=10）：組1，心臟移植+PBS治療組；組2，心臟移植+ hIgG_1（10μg/g/天術(shù)后0~6天）治療組；組3，心臟移植+Tim-1-Fc（10μg/g/天術(shù)后0~6天）腹腔注射治療組。專人記錄心臟移植物存活時間。于術(shù)后第7天處死小鼠，收集血液、心臟、脾臟標(biāo)本。Real-time PCR檢測心臟移植物內(nèi)淋巴細(xì)胞表面分子CD3, CD11b和炎性細(xì)胞因子IL-2, IFN-γ, IL-4, IL-10和轉(zhuǎn)錄因子Foxp3表達(dá)情況，病理檢查心臟移植物內(nèi)炎性細(xì)胞浸潤和組織破壞情況。磁珠分選受體小鼠脾臟CD4~+ T細(xì)胞，用BALB/c小鼠DCs刺激，~3H摻入法檢測其增殖情況，ELISA檢測Th1，Th2細(xì)胞因子水平。FCM檢測受體小鼠脾臟中CD4~+Foxp3~+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞占總CD4~+T細(xì)胞比例，以及CD4~+CD25~- T細(xì)胞培養(yǎng)體系中加入Tim-1-Fc后Foxp3的表達(dá)變化。結(jié)果：三組小鼠心臟移植物存活時間分別為6.5±0.5，6.7±0.4和17.1±1.1天。Tim-1-Fc治療組移植物內(nèi)IL-2、IFN-γ、CD11b、CD3 mRNA表達(dá)水平顯著較低，病理損害亦明顯減輕，但I(xiàn)L-10水平升高（P0.05）；Tim-1-Fc組受體脾臟來源CD4~+ T細(xì)胞接受同種異基因DCs刺激后增殖水平顯著較低（P0.05）；受體小鼠脾臟中CD4~+Foxp3~+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞占總CD4~+T細(xì)胞比例顯著升高（P0.05），但Tim-1-Fc并不能直接誘導(dǎo)CD4~+CD25~- T細(xì)胞表達(dá)Foxp3。結(jié)論：Tim-1-Fc能減輕小鼠心臟移植物Th1細(xì)胞因子表達(dá)和炎性細(xì)胞浸潤，促進(jìn)Th2細(xì)胞因子表達(dá)，降低受體脾臟內(nèi)供體反應(yīng)性T細(xì)胞對同種抗原的反應(yīng)能力，顯著延長移植物存活期；Tim-1-Fc雖不能直接誘導(dǎo)Tregs，但它通過調(diào)節(jié)Th1/Th2平衡向Th2發(fā)展，提高脾臟內(nèi)CD4~+Foxp3~+ T細(xì)胞比例，調(diào)節(jié)Teffs/Tregs平衡向Tregs偏移，成功抑制了小鼠心臟移植物排斥反應(yīng)，使其有望成為抗排斥治療的新藥物。
[Abstract]:The activation , proliferation and differentiation of CD4 ~ + T helper cells are the key links of antigen - specific immune response .

T cell immunoglobulin ( Tim ) is a new molecule associated with cell activation in T cell and DCs . The family of TIM gene is located in 11B1.1 . There are 8 genes encoding protein Tim - l ~ 4 and four hypothetical proteins Tim - 5 ~ 8 . The structure of Tim - 1 , 3 , 4 ( without Tim - 2 ) . Tim is a class of transmembrane glycoprotein with common motif .

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本文編號：1695966