本文選題：重組牛IFN-γ　切入點(diǎn)：單克隆抗體　出處：《中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院》2012年碩士論文

【摘要】：牛結(jié)核病（bovine tuberculosis）是一種人畜共患的慢性消耗性傳染病，主要由牛分枝桿菌(Myeobacterium bovis)感染所引起，可以通過病畜傳染給人或其他動(dòng)物。該病不僅嚴(yán)重阻礙了我國奶牛養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，也嚴(yán)重危害著人類的健康。國際上普遍采用“檢疫-撲殺”的措施進(jìn)行該病的防控。有關(guān)牛結(jié)核病的診斷方法有很多種，主要以提純牛結(jié)核菌素（PPD）皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)為主，但該方法在判定結(jié)果時(shí)存在一定的主觀性，易出現(xiàn)假陽性和假陰性，為結(jié)核病的防控帶來了諸多不利。γ-干擾素(IFN-γ)釋放試驗(yàn)是牛結(jié)核病體外免疫學(xué)檢測(cè)新方法，該方法操作簡(jiǎn)單、特異性和靈敏性高，并且為非侵入性檢測(cè)，可以重復(fù)多次檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果更為客觀、可靠，在澳大利亞等多個(gè)發(fā)達(dá)國家推行使用。目前，國內(nèi)也開始小范圍使用牛分枝桿菌IFN-γ ELISA檢測(cè)試劑盒，但由于所使用的試劑盒主要依賴進(jìn)口，價(jià)格昂貴，嚴(yán)重阻礙了其在臨床檢測(cè)中的應(yīng)用。鑒于以上現(xiàn)實(shí)考慮，本研究從以下四個(gè)方面進(jìn)行了相關(guān)探究，為進(jìn)一步建立牛IFN-γ免疫學(xué)檢測(cè)方法提供基礎(chǔ)。 1.牛IFN-γ的原核表達(dá)及鑒定 用RT-PCR方法擴(kuò)增出牛IFN-γ的基因片段，并成功構(gòu)建原核重組質(zhì)粒pET-32a(+)-IFN-γ和pGEX-6p-1-IFN-γ，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至BL21(DE3)大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)0.5mM IPTG誘導(dǎo)后成功表達(dá)重組牛IFN-γ，，分別命名為rIFN-γ-His和rIFN-γ-GST。SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示，兩種重組蛋白均為可溶性表達(dá)，大小分別為36ku、43ku。Western blotting及ELISA分析結(jié)果顯示，rIFN-γ-His和rIFN-γ-GST具有良好的免疫原性。MDBK/VSV抗病毒試驗(yàn)結(jié)果顯示，rIFN-γ-His和rIFN-γ-GST具有一定的抗病毒活性，rIFN-γ-His抗病毒活性為4056IU/mg，rIFN-γ-GST抗病毒活性為5078IU/mg。 2.牛IFN-γ的桿狀病毒表達(dá)及鑒定 以pET-32a(+)-IFN-γ為模板擴(kuò)增出牛IFN-γ的基因片段，定向克隆至pFastBacTMHTA中構(gòu)建重組質(zhì)粒pFastBacTMHTA-IFN-γ，轉(zhuǎn)化至DH10Bac感受態(tài)細(xì)胞中獲得重組穿梭質(zhì)粒Bacmid-IFN-γ，轉(zhuǎn)染sf21昆蟲細(xì)胞獲得重組桿狀病毒Bac-IFN-γ。應(yīng)用sf21昆蟲細(xì)胞懸浮培養(yǎng)技術(shù)大量表達(dá)目的蛋白，命名為rIFN-γ-Bac。SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示，rIFN-γ-Bac為可溶性表達(dá)。Western blotting分析結(jié)果顯示，重組牛IFN-γ被進(jìn)行了有效的糖基化修飾，包括大小分別為16.8ku、20.8ku和22ku的三種重組蛋白。BOVIGAM牛分枝桿菌IFN-γ ELISA檢測(cè)試劑盒檢測(cè)結(jié)果顯示，rIFN-γ-Bac有良好的免疫原性。MDBK/VSV抗病毒試驗(yàn)結(jié)果顯示，rIFN-γ-Bac具有很高的抗病毒活性，抗病毒活性為1.05×10~5IU/mg。蛋白質(zhì)譜鑒定結(jié)果顯示，所獲得的6段多肽序列與牛IFN-γ中的氨基酸序列完全匹配，進(jìn)一步證實(shí)了所表達(dá)的rIFN-γ-Bac確為牛IFN-γ。 3.抗牛IFN-γ單克隆抗體的制備及鑒定 用純化后的rIFN-γ-Bac免疫6～8周齡的BALB/c小鼠，在PEG4000融合劑的作用下進(jìn)行小鼠脾臟細(xì)胞與SP2/0細(xì)胞融合，經(jīng)篩選后獲得1A3、2A7、4A5、3E4、3E5、2G3共6株單克隆抗體細(xì)胞株。亞類鑒定結(jié)果表明，1A3、4A5、2G3屬于IgG2b型，3E5屬于IgG1型，2A7、3E4屬于IgM型。間接ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示，6株單克隆抗體均可以特異性的識(shí)別rIFN-γ-His、rIFN-γ-GST和rIFN-γ-Bac。間接ELISA檢測(cè)腹水效價(jià)均達(dá)到1:10~5以上，經(jīng)HiTrap~(TM) protein G HP親和層析柱純化出高純度的鼠抗牛IFN-γ單克隆抗體。以PPD刺激牛PBMC產(chǎn)生牛IFN-γ，將細(xì)胞固定后進(jìn)行間接免疫熒光試驗(yàn)，結(jié)果顯示1A3、2A7、3E4、3E5能與刺激后的細(xì)胞結(jié)合產(chǎn)生特異性熒光，表明1A3、2A7、3E4、3E5可以結(jié)合天然牛IFN-γ。 4.抗牛IFN-γ多克隆抗體的制備及鑒定 用純化后的rIFN-γ-His、rIFN-γ-GST分別免疫新西蘭白兔，收集血清后用HiTrap~(TM) protein GHP親和層析柱純化出高純度的抗牛IFN-γ多克隆抗體。間接ELISA方法測(cè)定多抗的效價(jià)可達(dá)到1:4×10~5以上。以PPD刺激牛PBMC產(chǎn)生牛IFN-γ，將細(xì)胞固定后進(jìn)行間接免疫熒光試驗(yàn)，結(jié)果顯示多抗能特異性結(jié)合天然牛IFN-γ。用純化后的多抗包被ELISA板，聯(lián)合BOVIGAM試劑盒中的HRP標(biāo)記鼠抗牛IFN-γ單克隆抗體，采用雙抗體夾心法檢測(cè)PPD刺激的結(jié)核病陽性牛血漿，結(jié)果顯示所制備的多抗能捕獲處理血漿中的天然牛IFN-γ，具有良好的親和力和較高的特異性。通過優(yōu)化試驗(yàn)確定了多抗的最佳包被濃度為5μg/mL，最佳封閉劑為10%FBS，最佳顯色時(shí)間為25min。 綜上所述，我們成功表達(dá)并純化出具有良好反應(yīng)原性的重組牛IFN-γ， rIFN-γ-Bac抗病毒生物學(xué)活性最佳。在此基礎(chǔ)上我們進(jìn)行了牛IFN-γ單克隆抗體和多克隆抗體的初步制備及鑒定，所獲得的多克隆抗體對(duì)天然牛IFN-γ具有良好的親和力和較高的特異性。為進(jìn)一步建立牛IFN-γ免疫學(xué)檢測(cè)方法奠定了基礎(chǔ)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號(hào)】：R378;S855.2

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1682755