本文選題：EBO-Zaire　切入點(diǎn)：GP1蛋白　出處：《北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院》2011年碩士論文

【摘要】：埃博拉病毒包膜蛋白GP細(xì)胞毒性機(jī)理探討 埃博拉病毒(Ebola virus)屬于絲狀病毒科(Filoviridae),為單股負(fù)鏈RNA包膜病毒,分4個亞型,即埃博拉-扎伊爾型(EBO-Zaire)、埃博拉-蘇丹型(EBO-Sudan)、埃博拉-萊斯頓型(EBO-Reston)和埃博拉-科特迪瓦型(EBO-Ivory Coast)。埃博拉病毒能夠引起人嚴(yán)重出血熱(Ebola hemorrhagic fever, EHF),被列為生物安全第四級(Biosafety Level 4)病毒,其中EBO-Zaire致死率高達(dá)90%。埃博拉病毒包膜蛋白GP (Glycoprotein)是唯一的表面包膜蛋白,在介導(dǎo)病毒進(jìn)入細(xì)胞過程中發(fā)揮重要作用,同時GP被認(rèn)為是決定埃博拉致病性一個重要因素。研究表明,體外通過轉(zhuǎn)染表達(dá)GP基因的質(zhì)�；蛳俨《巨D(zhuǎn)染GP基因進(jìn)入宿主細(xì)胞,能夠?qū)е滤拗骷?xì)胞的脫落,表明埃博拉病毒包膜蛋白GP具有細(xì)胞毒性,但是其機(jī)理不詳(1)。彌漫性血管內(nèi)凝血(Disseminated Intravascular Coagulation,DIC)是埃博拉出血熱的主要特征之一,血管內(nèi)皮細(xì)胞被認(rèn)為埃博拉病毒的致病機(jī)理中發(fā)揮著重要作用,有報(bào)道表明埃博拉病毒包膜蛋白是導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能異常重要因素(1)。本研究論文通過體外表達(dá)和純化EBO-Zaire包膜蛋白GP亞單位GP1-Fc融合蛋白,將純化的包膜蛋白加入到人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs),首次發(fā)現(xiàn)純化的包膜蛋白GP1能夠引起內(nèi)皮細(xì)胞的脫落。實(shí)驗(yàn)表明在蛋白終濃度為800 nmo1-1時,內(nèi)皮細(xì)胞脫落現(xiàn)象比較明顯,并且在蛋白處理后24 h小時,內(nèi)皮細(xì)胞開始出現(xiàn)脫落現(xiàn)象。因此,本研究首次在體外建立了GP1蛋白引起人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞脫落的細(xì)胞毒性模型,并且發(fā)現(xiàn)GP1蛋白能夠引起HUVECs的血管內(nèi)皮生長因子受體2(VEGFR2)上調(diào),但具體機(jī)理仍然不清楚。并且已提取HUVECs細(xì)胞mRNA,擬通過二代測序的方法探討GP1蛋白引起人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞脫落的機(jī)理。 鑒于埃博拉病毒的高致病性和傳染性,埃博拉假病毒能夠代替活病毒的部分研究,本實(shí)驗(yàn)探討通過三質(zhì)粒共轉(zhuǎn)和二質(zhì)粒共轉(zhuǎn)的方法包裝埃博拉假病毒的可行性。通過共轉(zhuǎn)染pQCXIX(含GFP報(bào)告基因),gag/pol質(zhì)粒和pEAK13GP三個質(zhì)粒包裝表達(dá)GFP報(bào)告基因的埃博拉假病毒；通過共轉(zhuǎn)染pNL4-3.Luc.R-E-和pEAK13GP兩個質(zhì)粒包裝表達(dá)熒光素酶報(bào)告基因的埃博拉假病毒。實(shí)驗(yàn)表明三質(zhì)粒共轉(zhuǎn)包裝的埃博拉假病毒滴度較低,二質(zhì)粒共轉(zhuǎn)包裝假病毒感染293T細(xì)胞后熒光素酶報(bào)告基因的表達(dá)較高。 研制包膜蛋白GP抗體,對于埃博拉病毒的致病機(jī)理以及藥物研發(fā)方面均有非常重要的作用,但是市場上至今沒有相應(yīng)的埃博拉病毒GP單克隆抗體銷售,本實(shí)驗(yàn)探討埃扎伊爾-埃博拉病毒(Zaire Ebola virus)包膜蛋白(GP) DNA疫苗誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生中和抗體的特性及研制埃博拉病毒DNA疫苗的可行性。通過構(gòu)建埃博拉病毒包膜蛋白GP真核表達(dá)質(zhì)粒pEAK13CD5LGP,采用100μg劑量的質(zhì)粒免疫小鼠,以純化的埃博拉病毒包膜蛋白亞單位融合蛋白(GP1-Fc)作為抗原,通過ELISA檢測及Western blot驗(yàn)證測定血清抗體滴度及特異性。實(shí)驗(yàn)表明100μg質(zhì)粒免疫小鼠三次后,小鼠血清中GP中和抗體滴度達(dá)到1：2000。含埃博拉病毒包膜蛋白GP基因的DNA疫苗(pEAK13CD5LGP)能夠誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生高滴度和持久的中和抗體,作為埃博拉病毒疫苗具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號】：R373

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本文編號：1681215