本文選題：WT1　切入點：熱休克蛋白70　出處：《山西醫(yī)科大學》2011年博士論文

【摘要】：目的 WT1(Wilms’tumor gene 1)是最早發(fā)現(xiàn)與Wilms’腫瘤發(fā)生發(fā)展有關(guān)的基因,在成人僅在少量的正常組織表達,但在各型白血病、骨髓異常增生綜合征及多種實體瘤呈高表達,并與疾病的不良預后有相關(guān)性。反義寡核苷酸抑制WT1表達,致使白血病細胞及實體瘤細胞生長停止,以及WT1能誘導特異性的細胞毒性T淋巴細胞(cytotoxic T lymphocyte,CTL)反應均提示W(wǎng)T1可作為廣譜性免疫治療的理想靶原。 迄今,基于WT1的表位肽疫苗已進入臨床試驗,并初見成效。然而目前研究者多采用單一CTL表位的疫苗,難免免疫原性差,且由于T細胞介導的免疫應答受主要組織相容性復合物(major histocompatibility complex,MHC)限制性,某一WT1的表位疫苗可能僅僅適用于少部分人類白細胞抗原(human leukocytes antigen,HLA)相合的患者,因此該疫苗的應用受到限制。 構(gòu)建多表位WT1的核酸疫苗可以彌補上述缺點,其優(yōu)越性表現(xiàn)為:①內(nèi)源性表位提呈可避免表位肽的降解,產(chǎn)生持久的細胞和體液免疫應答;②同時構(gòu)建WT1的多個優(yōu)勢表位或受不同HLA限制性的表位,可有效應防止免疫逃逸和突破HLA限制;③同時構(gòu)建WT1輔助性T細胞(helper T cell,Th)表位,其激發(fā)的CD4+T細胞,不僅可以更有效的激發(fā)和維持CTL免疫應答,而且可以產(chǎn)生特異性的抗腫瘤應答~[1] ;④易于設計和構(gòu)建,且制備和貯存方便。此外,根據(jù)具體需要,可以將免疫調(diào)節(jié)因子構(gòu)建于載體使其共表達,誘導產(chǎn)生最適免疫應答。因此,多表位基因疫苗在WT1抗原免疫治療中具有廣泛應用前景。 基因佐劑是提高基因疫苗免疫效果的有效手段,研究表明,結(jié)核分枝桿菌熱休克蛋白HSP70(mHSP70)是良好的免疫佐劑,其羧基端HSP70_(359-610)是其有效佐劑部位,可與CD40分子結(jié)合,通過p38信號通路誘導DC的成熟和極化Th1反應。而HSP70_(407-426)是位于mHSP70多肽結(jié)合區(qū)p359-610的一個刺激表位,選擇該區(qū)域能比HSP70更顯著的刺激DCs成熟,且這種作用不會被HSP70抑制表位p457-496所抑制~[2]。因此,mHSP70_(407-426)作為天然免疫佐劑在基因疫苗開發(fā)中具有潛在應用價值。 經(jīng)查閱文獻,目前國內(nèi)外尚未見有WT1多表位基因疫苗的報道,本文擬利用基因工程的方法將WT1多個CTL和Th細胞表位克隆至真核表達質(zhì)粒pcDNA3.1中,構(gòu)建WT1抗原多表位基因疫苗pcDNA-WT1。為獲得更好的免疫效果,同時以mHSP70的刺激表位p407-426作為免疫佐劑,嘗試構(gòu)建WT1多表位與熱休克蛋白70刺激表位融合基因疫苗pcDNA-WT1-HSP70_(407-426),并探討WT1抗原多表位基因疫苗及融合基因疫苗在小鼠誘導免疫應答的能力,研究其對荷瘤小鼠的抑瘤效應。此外,利用pcDNA-WT1-HSP70_(407-426)轉(zhuǎn)染的HLA-A*0201~+外周血單個核細胞(PBMC)誘導自身淋巴細胞產(chǎn)生CTL,通過乳酸脫氫酶釋放法檢測HLA-A*0201~+限制性的CTL反應。 方法 1 WT1多表位盒的設計與合成 本研究在收集已發(fā)表WT1表位的基礎上,篩選具有良好免疫原性的WT1 CTL與Th表位進行表位盒組建,并采用理論結(jié)合軟件模擬的方法,通過蛋白酶體切割軟件(PAProC和NetChop)和DNA疫苗在線預測工具(DyNAVacS)優(yōu)化表位盒構(gòu)成后進行人工合成。 2 WT1多表位基因疫苗的設計與構(gòu)建 2.1質(zhì)粒構(gòu)建 將WT1多表位片段插入T載體構(gòu)建質(zhì)粒pUC57-WT1,經(jīng)測序驗證后,進行酶切獲得WT1多表位片段,然后將該片段克隆至真核表達質(zhì)粒pcDNA3.1中,構(gòu)建重組質(zhì)粒pcDNA-WT1; PCR擴增pGEM-mHSP70質(zhì)粒HSP70中刺激表位片段p407-426,插入真核表達質(zhì)粒pcDNA3.1,構(gòu)建質(zhì)粒pcDNA-HSP70_(407-426);將上述獲得的WT1多表位片段酶切插入質(zhì)粒pcDNA-HSP70_(407-426)刺激表位的上游,構(gòu)建質(zhì)粒pcDNA-WT1-HSP70_(407-426)。上述質(zhì)粒經(jīng)酶切、PCR和測序鑒定。 2.2轉(zhuǎn)染293T和Hela細胞 脂質(zhì)體介導法瞬時轉(zhuǎn)染293T細胞和Hela細胞,同時共轉(zhuǎn)染pcDNA-EGFP熒光質(zhì)粒,激光共聚焦顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效果。 2.3 RT-PCR和Westernblot驗證 轉(zhuǎn)染293T和Hela細胞48小時后,提取293T細胞總RNA,RT-PCR檢測多表位WT1和融合基因片段的表達;提取Hela細胞蛋白,Western blot法檢測WT1相應功能蛋白的表達。 3 WT1多表位基因疫苗的免疫原性研究 3.1動物免疫 C57BL/6雄性4-6周齡小鼠25只,隨機分為5組,即PBS對照組、空質(zhì)粒對照組、pcDNA- HSP70_(407-426)對照組、pcDNA-WT1實驗組和pcDNA-WT1-HSP70_(407-426)實驗組,每組5只。每只小鼠分別于0.25%鹽酸布比卡因預處理雙側(cè)股四頭肌48h后,注射質(zhì)粒共50μg。每間隔2周注射一次,共免疫3次。最后一次免疫后10天,分離小鼠脾臟淋巴細胞。 3.2免疫指標檢測 分離小鼠脾臟淋巴細胞后,通過MTT法檢測小鼠T淋巴細胞增殖、流式細胞儀檢測CD4+/CD8+T淋巴細胞亞群、ELISPOT法檢測WT1特異性的IFN-γ分泌頻數(shù)和LDH法檢測殺傷性T淋巴細胞(CTL)功能。 3.3疫苗對腫瘤的治療作用 4-6周齡C57BL/6小鼠25只,每組5只,分別在左前肢皮下接種高表達WT1的FBL3細胞(2x106/只)。7d后,小鼠肌肉接種DNA疫苗,注射質(zhì)粒共50μg,對照組注射PBS、空質(zhì)粒和pcDNA- HSP70_(407-426)。14d后加強免疫一次。待可觸及腫瘤后,測量腫瘤體積,記錄小鼠生存活動情況和存活率。 3.4 HLA-A*0201限制性CTL反應 分離健康HLA-A*0201患者外周血單個核細胞(PBMC),將其中一部分轉(zhuǎn)染pcDNA-WT1-HSP70_(407-426)后,與未轉(zhuǎn)染部分做混合淋巴細胞培養(yǎng)誘導自身淋巴細胞產(chǎn)生CTL,通過通過乳酸脫氫酶釋放法檢測HLA-A*0201限制性的CTL反應。 結(jié)果 1 WT1多表位盒的設計與合成 1.1表位肽的選取 選擇的WT1表位除能誘發(fā)良好的CTL或/和Th反應外,需盡量能與更多MHC分子結(jié)合。被選取的CTL表位有:WT1.37(VLDFAPPGA;HLA-A*0201)、WT1.187(SLGEQQYSV;HLA-A*0201/HLA-A*0206)和WT1.235(CMWNQMNL;HLA-A*0201/HLA-A*2402),Th表位有:WT1.121A(SGQAYMFPNAPYLPSCLES;HLA-DRB1*0401)和WT1.332(KRYFKLSHLQMHSRKH;HLA-DRB1*0405/HLA-DRB1*1501/HLA-DRB1*1502/HLA-DPB1*0901),其中WT1.121A中隱藏CTL表位WT1.126m(下劃線,HLA-A*0201/H2Db),此外,為了使構(gòu)建的表位能更好的突破MHC限制性,同時構(gòu)建了通用Th表位PADRE(KFVAAWTLKAAA)。 1.2表位盒的優(yōu)化與合成 為了使構(gòu)建的表位能夠發(fā)揮各自獨立的功能,不同的CTL表位之間加入蛋白酶體切割喜好位點如AAY、KK、KAA、KAAA、AAA和NAAA,并根據(jù)蛋白酶體切割預測軟件PAProC和NetChop優(yōu)化各表位間間隔序列。不同的Th表位采用柔性連接表位“GPGPG”進行連接。在此基礎上加入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)信號引導序列IgK以促進蛋白分泌,并加入包含ATG啟動信號和KOZAK序列,以引導正確的翻譯。通過在線預測工具DyNAVacS將得到的核苷酸序列按照真核偏愛密碼子進行優(yōu)化,之后人工合成,最終獲得理論上具有良好功能的WT1表位盒。 2 WT1多表位基因疫苗的設計與構(gòu)建 2.1質(zhì)粒構(gòu)建 經(jīng)酶切、PCR和測序鑒定,pcDNA-WT1、pcDNA-HSP70_(407-426)和pcDNA-WT1-HSP -70_(407-426)構(gòu)建成功。 2.2脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞24小時后,觀察綠色熒光蛋白表達,結(jié)果未轉(zhuǎn)染的對照細胞無熒光出現(xiàn),而轉(zhuǎn)染重質(zhì)粒的細胞有熒光出現(xiàn),表明重組質(zhì)粒能夠在真核細胞中成功表達。 2.3 RT-PCR和Westernblot驗證 提取轉(zhuǎn)有質(zhì)粒pcDNA-WT1、pcDNA-HSP70_(407-426)和pcDNA-WT1-HSP70_(407-426)的293T細胞總RNA,經(jīng)RT-PCR擴增得到WT1和HSP70_(407-426)各基因片段,證實經(jīng)質(zhì)粒載體攜帶的基因及重組基因均已在真核生物中得到正確轉(zhuǎn)錄;提取轉(zhuǎn)染有pcDNA-WT1-HSP70_(407-426)質(zhì)粒的Hela細胞總蛋白,WT1作為一抗,Western blot檢測結(jié)果表明,重組質(zhì)粒在相對分子質(zhì)量約29 000KD處有一特異性的蛋白反應帶,與預期大小一致。 3 WT1多表位基因疫苗的免疫原性研究 3.1免疫指標檢測 免疫小鼠后實驗結(jié)果顯示:①特異性T淋巴細胞增殖實驗:pcDNA-WT1免疫組和pcDNA-WT1- HSP70_(407-426)免疫組刺激指數(shù)同PBS、空質(zhì)粒和pcDNA- HSP70_(407-426)各對照組相比顯著升高(P0.01),但兩組間無明顯差異(P0.05);②CD4+/CD8+T淋巴細胞亞群:pcDNA-WT1免疫組和pcDNA-WT1-HSP70_(407-426)免疫組CD4+、CD8+T淋巴細胞數(shù)和CD4+/CD8+比值均顯著高于PBS、空質(zhì)粒和pcDNA- HSP70_(407-426)各對照組(p0.01),但兩組之間無明顯差異(p0.05);③WT1特異性的IFN-γ分泌頻數(shù):4條CTL表位肽混合物刺激各組脾臟淋巴細胞,ELISPOT檢測結(jié)果顯示,pcDNA-WT1免疫組和pcDNA-WT1-HSP70_(407-426)免疫組脾淋巴細胞中分泌IFN-γ的T細胞數(shù)較PBS、空質(zhì)粒和pcDNA- HSP70_(407-426)各對照組顯著增多(p0.01),但兩組間無顯著差異(p0.05);同時予4條CTL表位肽分別刺激pcDNA-WT1免疫組各小鼠脾臟淋巴細胞,均可檢測到脾淋巴細胞特異性IFN-γ分泌,其中經(jīng)WT1.235和WT1.126m多肽刺激組可檢測到高水平的IFN-γ分泌,而經(jīng)WT1.37或WT1.187多肽刺激組IFN-γ分泌水平較低,4組IFN-γ分泌水平均低于混合多肽刺激組(p0.01)。④特異性殺傷實驗顯示:pcDNA-WT1免疫組和pcDNA-WT1- HSP70_(407-426)組免疫的CTL殺傷活性高于PBS對照組、空質(zhì)粒組和pcDNA- HSP70_(407-426)組(p0.01),同樣兩組之間無明顯差異(p0.05)。 3.2疫苗對腫瘤的治療作用 pcDNA-WT1免疫組和pcDNA-WT1-HSP70_(407-426)免疫組接種的FBL3腫瘤體積顯著小于PBS對照組、空質(zhì)粒對照組和pcDNA- HSP70_(407-426)對照組(p0.01),荷瘤小鼠生存期顯著大于對照組(p0.01)。 3.3 HLA-A*0201限制性CTL反應 pcDNA-WT1- HSP70_(407-426)轉(zhuǎn)染的PBMC能有效誘導自身淋巴細胞產(chǎn)生CTL,細胞殺傷實驗顯示其能特異殺傷高表達WT1的腫瘤細胞并具有HLA-A*0201限制性。 結(jié)論 1在收集WT1表位的基礎上,采用理論結(jié)合軟件模擬的方法成功構(gòu)建了WT1表位盒。 2成功構(gòu)建了WT1多表位基因疫苗pcDNA-WT1和融合基因疫苗pcDNA-WT1- HSP70_(407-426)。 3構(gòu)建的WT1多表位基因疫苗pcDNA-WT1能夠有效誘導小鼠特異性免疫應答。 4多表位基因疫苗pcDNA-WT1在小鼠體內(nèi)具有抗瘤效應。 5以mHSP70_(407-426)作為免疫佐劑構(gòu)建的融合基因疫苗pcDNA-WT1- HSP70_(407-426),與基因疫苗pcDNA-WT1相比,誘導的免疫應答及抑瘤效應無明顯差別。 6 WT1各CTL表位可以在多表位的模式下發(fā)揮各自功能。 7 pcDNA-WT1-HSP70_(407-426)轉(zhuǎn)染HLA-A*0201+PBMC能有效誘導自身淋巴細胞產(chǎn)生CTL,該CTL能特異殺傷高表達WT1抗原的腫瘤細胞,并受HLA限制性。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：山西醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2011
【分類號】：R392

【參考文獻】

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本文編號：1680915