本文選題：產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌　切入點(diǎn)：K88菌毛蛋白　出處：《黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)》2011年碩士論文

【摘要】：產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌(Enterotoxigenic Escherichia coli,ETEC)是引起新生仔豬和斷奶仔豬黃痢、白痢、水腫等腹瀉疾病的主要病原菌之一,給我國(guó)乃至全世界養(yǎng)豬業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。ETEC的主要致病因子有黏附素(又稱定居因子抗原)和腸毒素,黏附素與小腸上皮細(xì)胞上的特異性受體相結(jié)合而定植于黏膜是引起仔豬腹瀉的前提條件。引起仔豬腹瀉的菌毛抗原主要有K88、K99、987P、F41及F17等類型,其中以K88、K99黏附素抗原最為常見。 本研究將PCR擴(kuò)增的K99和K88-LTB基因片段串聯(lián)克隆到可在大腸桿菌和干酪乳桿菌之間穿梭的表面表達(dá)載體pLA上,構(gòu)建得重組質(zhì)粒pLA-K99-K88-LTB,經(jīng)鑒定正確后,電轉(zhuǎn)入干酪乳桿菌,獲得了表達(dá)融合蛋白pLA-K99-K88-LTB的重組干酪乳桿菌表達(dá)系統(tǒng)。經(jīng)過SDS-PAGE、Western blot檢測(cè),約有90 kDa的融合蛋白得到表達(dá),蛋白大小與理論值相符合。間接免疫熒光技術(shù)和流式細(xì)胞術(shù)的檢測(cè)結(jié)果表明,融合蛋白成功地利用多聚谷氨酸跨膜蛋白pgsA基因展示在干酪乳桿菌菌體表面。 將重組干酪乳桿菌pLA-K99-K88-LTB/L.casei口服接種SPF級(jí)C57BL/6小鼠,免疫后不同時(shí)間檢測(cè)腸道、肺部和陰道沖洗液及糞便中抗K88、K99特異性sIgA抗體和血清中抗K88、K99特異性IgG水平;并測(cè)定免疫小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖情況;然后對(duì)免疫后的小鼠進(jìn)行攻毒保護(hù)性試驗(yàn)。間接ELISA結(jié)果顯示重組干酪乳桿菌pLA-K99-K88-LTB/L.casei免疫小鼠后能在血清中檢測(cè)到明顯的抗K88、K99特異性IgG抗體,糞便及洗液中檢測(cè)到明顯的抗K88、K99特異性sIgA抗體;淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果顯示,免疫組可產(chǎn)生明顯的細(xì)胞免疫應(yīng)答。攻毒后小鼠免疫組的保護(hù)率均高于80%,表明該重組菌對(duì)小鼠具有保護(hù)作用。此外,ELISA結(jié)果顯示,重組菌pLA-K99/L.casei、pLA-K88/L.casei免疫小鼠后體液免疫和細(xì)胞免疫水平均比重組干酪乳桿菌pLA-K99-K88-LTB/L.casei高。結(jié)果表明該重組干酪乳桿菌pLA-K99-K88-LTB/L.casei可誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生黏膜免疫應(yīng)答和系統(tǒng)免疫應(yīng)答,能有效地預(yù)防ETEC K88、K99的感染,為ETEC重組乳酸菌多價(jià)口服疫苗的研制提供了重要的物質(zhì)基礎(chǔ)。
[Abstract]:Enterotoxigenic Escherichia coli is one of the main pathogens causing diarrhea such as yellow dysentery, white dysentery and edema in newborn piglets and weaned piglets. The main pathogenic factors of ETEC are adhesion factor (also called settlement factor antigen) and enterotoxin. Binding of adhesion to specific receptors on small intestinal epithelial cells and colonization of mucous membrane is a prerequisite for diarrhea in piglets. The main types of bacterial hair antigens causing diarrhea in piglets are K88N K99987Pf41 and F17, among which K88K99 adhesion antigen is the most common. In this study, the K99 and K88-LTB gene fragments amplified by PCR were cloned into the surface expression vector pLA, which could shuttle between E. coli and Lactobacillus casei. The recombinant plasmid pLA-K99-K88-LTB was constructed. The recombinant plasmid pLA-K99-K88-LTB was successfully identified and electrotransferred to Lactobacillus casei. A recombinant Lactobacillus casei expression system expressing fusion protein pLA-K99-K88-LTB was obtained, and about 90 kDa fusion protein was detected by SDS-PAGEG Western blot. The results of indirect immunofluorescence and flow cytometry showed that the fusion protein was successfully displayed on the surface of Lactobacillus casei by polyglutamic acid transmembrane protein pgsA gene. The recombinant Lactobacillus casei (pLA-K99-K88-LTB/L.casei) was inoculated orally into SPF C57BL/6 mice. The levels of anti-K88K99 specific sIgA antibody in intestinal tract, lung, vaginal flushing fluid and feces were detected at different time after immunization, and the levels of anti-K88K99 specific IgG in serum were also detected. The results of indirect ELISA showed that the recombinant Lactobacillus casei pLA-K99-K88-LTB/L.casei immunized mice could detect anti-K88K99 specific IgG antibody in serum. The specific sIgA antibody against K88K99 was detected in feces and lotions, and the lymphocyte proliferation test showed that, The protective rate of the immunized group was higher than that of the control group, which indicated that the recombinant strain had protective effect on the mice. In addition, the results of Elisa showed that the protective rate of the recombinant strain was higher than that of the control group. The humoral and cellular immunity levels of the recombinant strain pLA-K99 / L.caseiia-pLA-K88 / L.casei were higher than that of the recombinant Lactobacillus casei pLA-K99-K88-LTB/L.casei. The results showed that the recombinant Lactobacillus casei pLA-K99-K88-LTB/L.casei could induce mucosal immune response and systemic immune response in mice. It can effectively prevent the infection of ETEC K88 K99 and provide an important material basis for the development of multivalent oral vaccine against ETEC recombinant lactic acid bacteria.
【學(xué)位授予單位】：黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號(hào)】：R378

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