發(fā)布時間：2018-03-28 08:19

  本文選題：EHEC　切入點：O157:H7　出處：《第三軍醫(yī)大學(xué)》2011年碩士論文

【摘要】：背景 腸出血性大腸桿菌(enterohaemorragic Escherichia coli,EHEC) O157:H7為重要的人畜共患傳染病原,其感染具有暴發(fā)流行、強烈的致病性與致死性和抗生素治療加劇病情等特點,同時它還可作為細菌武器與生物恐怖戰(zhàn)劑的原料,已成為全球性的公共衛(wèi)生問題。加強其致病機理的研究對提高由該菌引起的流行病、生物恐怖的預(yù)防和處理能力,具有重要的理論指導(dǎo)意義。 病原體和宿主的相互作用是決定感染的關(guān)鍵。EHEC O157:H7主要通過緊密粘附素intimin與其在上皮細胞膜表面的受體Tir(translocated intimin receptor)結(jié)合,粘附和定植于宿主細胞表面,引起特異性粘附擦拭損傷(attaching and effacing lesions, A/E lesions),同時分泌強烈致死性毒素志賀毒素(shiga toxin),最終引起宿主發(fā)生腹瀉、出血性腸炎及溶血性尿毒綜合征等嚴重并發(fā)癥。A/E損傷形成是一系列效應(yīng)分子參與的信號傳導(dǎo)過程,涉及包括細菌和宿主細胞的多種效應(yīng)分子間的相互作用。TccP(Tir Couple Cytoskeleton Protein,內(nèi)膜素受體偶聯(lián)細胞骨架蛋白)是近年研究新發(fā)現(xiàn)的EHEC O157:H7致病分子,它經(jīng)EHEC O157:H7的Ⅲ型分泌系統(tǒng)轉(zhuǎn)導(dǎo)入宿主細胞內(nèi),發(fā)揮致病作用。TccP含有富含脯氨酸的重復(fù)片段,該重復(fù)片段為與宿主細胞IRTKS效應(yīng)蛋白SH3結(jié)構(gòu)域相互作用的功能單元。EHEC O157菌株之間TccP的重復(fù)片段存在差異,這種差別可能與A/E損傷的形成和致病性有關(guān)。 前期課題組分離鑒定了一株弱毒的EHEC O157:H7,其具有3個脯氨酸富集重復(fù)片段TccP,介導(dǎo)A/E損傷能力下降[1]。為進一步闡明其致病的物質(zhì)基礎(chǔ),本研究擬在體外直接觀察TccP的3個脯氨酸富集重復(fù)片段TccP(3R)和IRTKS蛋白SH3結(jié)構(gòu)域的相互作用。 目的 1.采用DNA重組技術(shù)分別克隆表達TccP蛋白的3個脯氨酸富集重復(fù)片段(TccP(3R))和IRTKS蛋白SH3結(jié)構(gòu)域(SH3(IRTKS))。 2.利用Tricine-SDS-PAGE、Native-PAGE和免疫印記以及凝膠過濾層析和晶體培養(yǎng)分析TccP(3R)與SH3(IRTKS)在體外的相互作用。 方法 1.重組表達載體的構(gòu)建 通過PCR技術(shù)擴增TccP(3R)和SH3(IRTKS)基因片段,分別連接于原核表達質(zhì)粒pET28a(+)和pET30a(+)獲得重組質(zhì)粒。酶切、測序鑒定正確的陽性重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3),獲得重組工程菌。 2.重組蛋白的表達和純化 重組工程菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后,超聲破菌,Tricine-SDS-PAGE分析重組蛋白表達形式。TccP(3R)蛋白依次經(jīng)過Ni-NTA親和層析、陰離子交換層析和凝膠過濾層析;SH3(IRTKS)蛋白依次經(jīng)過Ni-NTA親和層析和凝膠過濾層析,進行蛋白純化。純化后TccP(3R)和SH3(IRTKS)蛋白經(jīng)蛋白超濾離心管濃縮,BCA法測定蛋白濃度。 3. TccP(3R)與SH3(IRTKS)體外結(jié)合實驗 根據(jù)TccP(3R)和SH3(IRTKS)的氨基酸序列,通過DNAStar軟件預(yù)測分子量。根據(jù)分子量和已測定的質(zhì)量濃度,換算摩爾濃度。將TccP(3R)和SH3(IRTKS)蛋白按照摩爾比1:10混合進行體外結(jié)合實驗。 4.體外結(jié)合實驗結(jié)果的分析 通過Tricine-SDS-PAGE、Native-PAGE和免疫印記對體外結(jié)合實驗得到的混合物進行分析。 利用凝膠過濾層析對體外結(jié)合實驗得到的混合物進行分析。蛋白標準品、TccP(3R)、SH3(IRTKS)以及體外結(jié)合實驗得到的混合物分別通過凝膠過濾層析Superdex75 10/300柱,獲得出峰體積。根據(jù)標準品蛋白出峰體積和其已知的分子量求得Kav和LogMw值,利用Kav和LogMw值算出回歸直線方程式,將TccP(3R)、SH3(IRTKS)及其混合物中蛋白的出峰體積代入方程式,算出各蛋白的分子量。求TccP(3R)與SH3(IRTKS)的分子量之和,通過與TccP(3R)- SH3(IRTKS)蛋白復(fù)合體分子量的比較,估算TccP(3R)與SH3(IRTKS)相互結(jié)合的比例。 5. TccP(3R)-SH3(IRTKS)復(fù)合體的晶體學(xué)研究 將體外結(jié)合實驗得到的混合物進行凝膠過濾層析,以獲得純化的TccP(3R)- SH3(IRTKS)蛋白復(fù)合體。應(yīng)用Hampton Research公司的晶體初篩試劑盒進行蛋白復(fù)合體結(jié)晶條件的初步篩選。 結(jié)果 1.酶切、DNA測序鑒定結(jié)果證實成功構(gòu)建了pET28a(+)-TccP(3R)和pET30a(+)-SH3(IRTKS)重組表達載體。 2.重組工程菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達后,超聲破菌并離心,上清和沉淀經(jīng)Tricine-SDS-PAGE分析,結(jié)果表明:TccP(3R)、SH3(IRTKS)均主要存在于上清中,目的蛋白經(jīng)純化后純度大于98%。 3.將純化的TccP(3R)和SH3(IRTKS)體外混合,Tricine-SDS-PAGE分析結(jié)果顯示:出現(xiàn)兩條分子量大小分別與TccP(3R)和SH3(IRTKS)相符的條帶;非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分析結(jié)果表明:原TccP(3R)條帶消失,出現(xiàn)一條新的蛋白帶;以兔抗TccP抗體為一抗進行免疫印跡檢測,結(jié)果顯示:新條帶能夠與抗TccP抗體反應(yīng)而顯色。 4.根據(jù)蛋白標準品的凝膠過濾層析出峰體積和分子量,通過回歸分析得到直線方程式:Kav=1.476608-0.27976*LogMw (R2=0.926). 5. TccP(3R)、SH3(IRTKS)及兩者復(fù)合體的凝膠過濾層析出峰體積分別為12.0ml、14.5ml和11.4ml,根據(jù)出峰體積求得分子量分別為24238、6698和33002。根據(jù)TccP(3R)、SH3(IRTKS)及兩者復(fù)合體分子量的關(guān)系,估算TccP(3R)與SH3(IRTKS)的結(jié)合比例約為1:1。 5.通過凝膠過濾層析獲得了TccP(3R)-SH3(IRTKS)蛋白復(fù)合體。 結(jié)論 1.采用基因工程技術(shù)高效表達了可溶性TccP(3R)、SH3(IRTKS)重組蛋白,并通過純化獲得了高純度的目的蛋白。 2. TccP(3R)與SH3(IRTKS)蛋白在體外能發(fā)生相互作用,并形成蛋白復(fù)合體。 3. TccP(3R)與SH3(IRTKS)相互結(jié)合的摩爾比約為1:1。 4.通過體外結(jié)合實驗和凝膠過濾層析,能夠制備TccP(3R)-SH3(IRTKS)蛋白復(fù)合體。 綜上所述,含3個重復(fù)片段的TccP蛋白能夠與IRTKS蛋白按照摩爾比1:1相互結(jié)合后形成蛋白復(fù)合體,而且,通過制備TccP(3R)-SH3(IRTKS)蛋白復(fù)合體,為進一步通過晶體學(xué)技術(shù)研究兩者的相互作用機制奠定了基礎(chǔ)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號】：R378

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本文編號：1675504