發(fā)布時間：2018-03-26 04:51

  本文選題：梅毒螺旋體　切入點：Tp0155　出處：《南華大學(xué)》2011年碩士論文

【摘要】：目的:探討梅毒螺旋體(Treponema pallidum, Tp)重組粘附蛋白Tp0155和Tp0483潛在的誘導(dǎo)巨噬細胞(Mφ)產(chǎn)生炎性細胞因子IL-6、IL-1β和TNF-α的能力;探討Tp0155和Tp0483誘導(dǎo)產(chǎn)生IL-6、IL-1β和TNF-α是否與NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有關(guān)。 方法:通過Genbank獲取所選Tp0155和Tp0483蛋白的基因序列,以Tp Nichols株全基因組DNA為模板,PCR擴增目的片段,將其亞克隆至原核表達載體pET28a(+)中構(gòu)建重組質(zhì)粒pET28a(+)/Tp0155和pET28a(+)/Tp0483,經(jīng)PCR、雙酶切、測序鑒定后轉(zhuǎn)化至表達宿主菌E.coli Rosseta中,IPTG誘導(dǎo)蛋白表達。采用SDS-PAGE和Western blot分析和鑒定表達產(chǎn)物;Ni-NTA親和層析柱純化重組蛋白,BCA法測定蛋白濃度;Detoxi-Gel?內(nèi)毒素去除膠去除重組蛋白中的內(nèi)毒素。用佛波酯(PMA)誘導(dǎo)THP-1細胞轉(zhuǎn)化為Mφ,并用Tp0155和Tp0483重組蛋白刺激Mφ,采用ELISA雙抗體夾心法檢測Mφ分泌炎性細胞因子IL-6、IL-1β和TNF-α的水平;提取Tp0155和Tp0483處理后的Mφ的總蛋白,Western blot檢測Mφ總蛋白中κB抑制蛋白(IκB)的降解情況。用NF-κB特異性抑制劑二硫代氨基甲酸吡咯烷(PDTC)預(yù)處理Mφ30 min,再以Tp0155和Tp0483重組蛋白刺激Mφ,分析其對IL-6、IL-1β和TNF-α產(chǎn)生的影響。 結(jié)果: PCR成功擴增Tp0155和Tp0483出基因目的片段,重組質(zhì)粒經(jīng)酶切和測序鑒定證實與Genbank上登錄序列完全一致;在IPTG誘導(dǎo)下,重組表達菌分別表達了一相對分子量約為46kDa(Tp0155)和47kDa(Tp0483)的重組蛋白,目的蛋白在菌體細胞內(nèi)以可溶性和包涵體形式存在,包涵體蛋白為主要存在形式,經(jīng)Ni-NTA親和純化后,純度在95%以上;內(nèi)毒素去除膠處理重組蛋白后,鱟實驗檢測內(nèi)毒素含量小于0.04EU/mL;0.5～5μg/mL Tp0155和0.5～7μg/mL Tp0483重組蛋白均能通過劑量依賴方式誘導(dǎo)PMA轉(zhuǎn)化后的Mφ產(chǎn)生IL-6、IL-1β和TNF-α炎癥因子的產(chǎn)量都隨著蛋白濃度的增加而增加,到達某個最高值后逐步減少。Tp0155的濃度在5μg/mL時,TNF-α的量達到高峰,為(963.85±29.66) pg/mL, Tp0155的濃度在7μg/mL時,IL-1β和IL-6的量達到高峰;Tp0483的濃度在5μg/mL時,TNF-α、IL-1β和IL-6的量同時達到高峰。且分泌水平呈一定的時間依賴性:炎癥因子的產(chǎn)量隨著時間延長而增加,分別在不同時間達到最高值,TNF-α在刺激24h后達到高峰,而IL-6和IL-1β為48h后達到高峰。Western blot結(jié)果顯示,Tp0155和Tp0483均能誘導(dǎo)Mφ內(nèi)IκB降解;經(jīng)PDTC處理后,Tp0155和Tp0483分別能使Mφ的IL-6產(chǎn)生量降至53%和49%;IL-1β產(chǎn)生量降至52%和54%,TNF-α產(chǎn)量分別降至57%和58%。 結(jié)論: 1. Tp0155和Tp0483重組蛋白能通過時間和劑量依賴方式誘導(dǎo)Mφ產(chǎn)生IL-6、IL-1β和TNF-α。 2. Tp0155和Tp0483重組蛋白刺激Mφ后能誘導(dǎo)其細胞內(nèi)IκB降解。 3. Tp0155和Tp0483重組蛋白刺激Mφ產(chǎn)生IL-6、IL-1β和TNF-α可能與NF-κB的激活有關(guān)。
[Abstract]:Aim: to investigate the ability of Treponema pallidum (TP) recombinant adhesion protein Tp0155 and Tp0483 to induce macrophage M 蠁) to produce inflammatory cytokines IL-6, IL-1 尾 and TNF- 偽, and to explore whether the production of IL-6T IL-1 尾 and TNF- 偽 by Tp0155 and Tp0483 is related to NF- 魏 B signal transduction pathway. Methods: the gene sequence of Tp0155 and Tp0483 protein was obtained by Genbank. The target fragment was amplified by PCR using the whole genome DNA of TP Nichols strain as template. The fragment was subcloned into the prokaryotic expression vector pET28a (pET28a) to construct the recombinant plasmids pET28a( P / Tp0155 and pET28a / Tp0483). SDS-PAGE and Western blot were used to analyze and identify the expression of recombinant protein, which was purified by affinity chromatography with Ni-NTA column. The protein concentration was determined by Detoxi-Gel? Endotoxin removal was used to remove endotoxin from recombinant protein. THP-1 cells were induced to be transformed into M 蠁 by phorbol ester (PMA). M 蠁 was stimulated by Tp0155 and Tp0483 recombinant protein. The levels of IL-6- 尾 and TNF- 偽 secreted by M 蠁 were detected by ELISA double antibody sandwich method. The degradation of 魏 B inhibitor I 魏 B in M 蠁 was detected by Western blot after Tp0155 and Tp0483 treatment. M 蠁 was pretreated with NF- 魏 B specific inhibitor, pyrrolidine dithiocarbamate, for 30 min, and then stimulated by Tp0155 and Tp0483 recombinant proteins. M 蠁, to analyze its effect on IL 6, IL 1 尾 and TNF- 偽 production. Results: the target fragments of Tp0155 and Tp0483 were successfully amplified by PCR, and the recombinant plasmid was confirmed by restriction endonuclease digestion and sequencing. A recombinant protein with a relative molecular weight of about 46kDa (Tp0155) and 47kDa (Tp0483) was expressed respectively. The target protein existed in the form of soluble and inclusion bodies in the cells, and the inclusion body protein was used as the main existing form. The protein was purified by Ni-NTA affinity. The purity is more than 95%. Tachypleus test showed that endotoxin content was less than 0.04 EUP / mL 0.5 渭 g/mL Tp0155 and 0.5 渭 g/mL Tp0483 recombinant protein could induce the production of IL-6 IL-1 尾 and TNF- 偽 inflammatory factors in M 蠁 transformed by PMA in a dose-dependent manner. When the concentration of .Tp0155 gradually decreased at 5 渭 g/mL, the amount of TNF- 偽 reached its peak. For 963.85 鹵29.66) PG / mL, the concentrations of IL-1 尾 and IL-6 reached the peak at 7 渭 g/mL and the concentrations of Tp0483 reached the peak at 5 渭 g/mL, and the levels of TNF- 偽 and IL-1 尾 and IL-6 reached the peak at 5 渭 g/mL, and the secretion level was in a time-dependent manner: the production of inflammatory factors increased with time. The peak value of TNF- 偽 was reached at different time after 24 h stimulation, while that of IL-6 and IL-1 尾 reached the peak at 48 h. The results showed that Tp0155 and Tp0483 could induce the degradation of I 魏 B in M 蠁. After treated with PDTC, Tp0155 and Tp0483 could reduce the IL-6 production of M 蠁 to 53% and IL-1 尾 to 52% and 54 TNF- 偽 to 57% and 58%, respectively. Conclusion:. 1. The recombinant protein of Tp0155 and Tp0483 could induce the production of IL-6 IL-1 尾 and TNF- 偽 by M 蠁 in a dose-and time-dependent manner. 2. I 魏 B degradation was induced by stimulation of M 蠁 by Tp0155 and Tp0483 recombinant proteins. 3. The production of IL 6, IL 1 尾 and TNF- 偽 by M 蠁 stimulated by Tp0155 and Tp0483 recombinant proteins may be related to the activation of NF- 魏 B.
【學(xué)位授予單位】：南華大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號】：R363

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本文編號：1666410