本文選題：組蛋白翻譯后修飾　切入點(diǎn)：質(zhì)譜　出處：《復(fù)旦大學(xué)》2012年博士論文

【摘要】：組蛋白翻譯后修飾是當(dāng)今表觀遺傳學(xué)的一個(gè)研究熱點(diǎn),其中,基于質(zhì)譜對(duì)組蛋白翻譯后修飾位點(diǎn)的鑒定和發(fā)現(xiàn)的研究越來(lái)越受到科研工作者的關(guān)注：同時(shí),定量蛋白質(zhì)組學(xué)作為蛋白質(zhì)組學(xué)的一個(gè)重要分支,有關(guān)其新方法的研究對(duì)于推動(dòng)整個(gè)蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)展起著舉足輕重的作用。本研究工作基于質(zhì)譜,建立了多種組蛋白翻譯后修飾位點(diǎn)鑒定方法,并且可以應(yīng)用到新翻譯后修飾位點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)中；另外還建立了一個(gè)體內(nèi)終端氨基酸標(biāo)記定量新方法,并且對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的定量分析和優(yōu)化進(jìn)行了軟件設(shè)計(jì)、編輯、測(cè)試和應(yīng)用。為了使該方法的應(yīng)用更加全面和廣泛,對(duì)此體內(nèi)終端氨基酸標(biāo)記定量新方法進(jìn)行了系統(tǒng)的改進(jìn)。 論文的主要內(nèi)容如下： 1)概述了組蛋白的基本概念、變體類(lèi)別、翻譯后修飾的種類(lèi)、重要生物功能以及組蛋白翻譯后修飾的難點(diǎn)和主要解決方法,尤其是基于質(zhì)譜的各種分析方法。介紹了定量蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)展現(xiàn)狀,各種定量蛋白質(zhì)組學(xué)的方法原理、優(yōu)缺點(diǎn)和發(fā)展應(yīng)用,一些新出現(xiàn)的定量蛋白質(zhì)組學(xué)新方法和各種定量蛋白質(zhì)組學(xué)分析軟件。 2)利用濃硫酸提取細(xì)胞組蛋白的方法,實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞中組蛋白的有效提�。煌ㄟ^(guò)在線反相色譜RPLC-高分辨LTQ-Orbitrap組蛋白分子質(zhì)量測(cè)定方法,在蛋白水平上獲得各種組蛋白變體和組蛋白翻譯后修飾(PTMs)的分布,并且將該方法應(yīng)用到多個(gè)肝癌細(xì)胞株的組蛋白分子質(zhì)量比較的研究中；建立了多酶酶解和高分辨LTQ-Orbitrap質(zhì)譜結(jié)合的組蛋白酶解肽段PTMs位點(diǎn)鑒定的方法,在獲得組蛋白整體PTMs分布的前提下,實(shí)現(xiàn)了組蛋白酶解肽段PTMs位點(diǎn)的鑒定,并且在人肝癌細(xì)胞QGY-7703中組蛋白H4上發(fā)現(xiàn)一個(gè)新的甲基化位點(diǎn)R67；同時(shí)采用氣泵手動(dòng)上樣.親水相互作用色譜HILIC-高分辨LTQ-Orbitrap質(zhì)譜結(jié)合的組蛋白酶解肽段PTMs位點(diǎn)鑒定的方法對(duì)人肝癌細(xì)胞QGY-7703中組蛋白H3的PTMs進(jìn)行了分析以及利用MALDI質(zhì)譜低分子量端特征碎片離子檢測(cè)方法對(duì)一、二、三甲基化和乙�；疨TMs位點(diǎn)進(jìn)行了探索。 3)基于目前的定量蛋白質(zhì)組學(xué)方法,為解決一級(jí)質(zhì)譜質(zhì)量差異定量方法的復(fù)雜度高和靈敏度低的不足、相同一級(jí)質(zhì)量二級(jí)質(zhì)量標(biāo)簽定量方法的低質(zhì)量端“抑制效應(yīng)”難題,建立了一種體內(nèi)終端氨基酸標(biāo)記(IVTAL)的定量蛋白質(zhì)組學(xué)新方法。該方法結(jié)合一組具有相同質(zhì)量增加的重同位素標(biāo)記的精氨酸13C6-Arg和賴氨酸13C6-Lys以及一組特異性內(nèi)切蛋白酶Lys-N和Arg-C,經(jīng)過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)和酶解后,實(shí)現(xiàn)了通過(guò)二級(jí)質(zhì)譜在整個(gè)質(zhì)量范圍內(nèi)b,y碎片離子對(duì)峰強(qiáng)度來(lái)定量肽段和蛋白。相比傳統(tǒng)的一條肽段定量?jī)H由一個(gè)比值決定的方法,IVTAL采用多對(duì)b,y碎片離子來(lái)定量一條肽段,因此肽段的定量信息更加準(zhǔn)確和可靠。作為一種高精度和高可靠的定量蛋白質(zhì)組學(xué)方法,IVTAL適用于所有細(xì)胞培養(yǎng)設(shè)計(jì)的定量實(shí)驗(yàn),尤其適用于一條肽段中多種翻譯后修飾類(lèi)型和多個(gè)翻譯后修飾位點(diǎn)的定量研究。另外,該方法可實(shí)現(xiàn)蛋白定性和定量的同步性,其中的b,y碎片離子對(duì)還可以為定性分析提供更加準(zhǔn)確的補(bǔ)充信息。 4)基于IVTAL方法和SEQUEST搜索引擎,以及Perl語(yǔ)言和Matlab軟件,獨(dú)立地開(kāi)發(fā)了一種定量分析和優(yōu)化軟件Isobaric Tandem MS Quantitative (ITMSQ)。該軟件主要是通過(guò)計(jì)算串級(jí)質(zhì)譜中b,y碎片離子對(duì)的峰強(qiáng)度比值來(lái)得到肽段和蛋白的定量信息,ITMSQ適用于包括IPTL和iMSTIQ在內(nèi)的所有IsobaricMS2定量方法。另外,針對(duì)IsobaricMS2定量方法中b,y碎片離子對(duì)共碎裂的串級(jí)質(zhì)譜圖,ITMSQ還增加了“譜圖拆分”的優(yōu)化模塊,大大增加了IVTAL方法定性和定量的數(shù)據(jù)量,保證了定量數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確度和可靠性。利用IVTAL方法標(biāo)記HeLa細(xì)胞的質(zhì)譜數(shù)據(jù)對(duì)ITMSQ的定量和優(yōu)化功能進(jìn)行了成功的測(cè)試并獲取IVTAL方法中變化蛋白的上、下調(diào)界限。分別考察了SEQUEST數(shù)據(jù)庫(kù)搜索時(shí)b,y離子對(duì)的質(zhì)量偏差和ITMSQ軟件提取b,y離子時(shí)離子強(qiáng)度對(duì)IVTAL方法定量準(zhǔn)確度的影響。 5)為了使IVTAL方法更加簡(jiǎn)單、方便和廣泛地應(yīng)用到定量蛋白質(zhì)組學(xué)的研究中,本研究對(duì)IVTAL方法進(jìn)行了系統(tǒng)的優(yōu)化,結(jié)合trypsin酶解和二甲基化標(biāo)記形成一個(gè)全面的IVTAL方法(G-IVTAL)。兩株細(xì)胞分別采用含有正常精氨酸和賴氨酸或者重精氨酸15N4-Arg和重賴氨酸13C615N2-Lys的細(xì)胞培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng),然后細(xì)胞全蛋白的trypsin酶解產(chǎn)物分別同氘代甲醛(CD20)或者正常甲醛(CH20)進(jìn)行N端二甲基化標(biāo)記反應(yīng),最后的肽段產(chǎn)物在一級(jí)質(zhì)譜圖中質(zhì)量相同而在串級(jí)質(zhì)譜中產(chǎn)生b,y碎片離子對(duì),同樣通過(guò)計(jì)算b,y碎片離子對(duì)峰的強(qiáng)度比,得到肽段和蛋白的定量信息。與IVTAL方法相比,G-IVTAL方法不僅保證了定量信息的準(zhǔn)確度和可靠性,而且所有的酶解肽段都可以提供定性和定量分析,大大增加了定性和定量數(shù)據(jù)的信息。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類(lèi)號(hào)】：R341

【共引文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 劉鐵權(quán);孫明軍;魏敏杰;;組蛋白去乙酰化酶1、2在大腸癌及腺瘤組織中的表達(dá)及其與臨床病理的關(guān)系[J];世界華人消化雜志;2010年30期

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本文編號(hào)：1663644