發(fā)布時間：2018-03-24 16:24

  本文選題：芘探針　切入點：單核苷酸多態(tài)性　出處：《吉林大學》2011年博士論文

【摘要】：核酸和蛋白質(zhì)是生物體賴以生存的基本物質(zhì),也是生命活動的物質(zhì)基礎(chǔ)。核酸存儲和傳遞遺傳信息并指導蛋白質(zhì)的合成,是生命的締造者。蛋白質(zhì)負責實現(xiàn)各種生物功能,是生命活動的主要表現(xiàn)者。隨著生命科學和生物醫(yī)學的發(fā)展,研究疾病與核酸、蛋白質(zhì)的關(guān)系逐漸成為熱點。本質(zhì)上說,基因突變是疾病的出現(xiàn)的誘因。DNA發(fā)生突變,轉(zhuǎn)錄出錯誤的遺傳信息,導致表達出來的蛋白質(zhì)功能異常,最終引發(fā)疾病。那么,預(yù)防和診斷疾病的方法就變得尤為重要。核酸是否出現(xiàn)突變,蛋白含量是否超出正常范圍,這些指標都有助于我們監(jiān)控疾病。因此,建立新方法來檢測核酸和蛋白質(zhì)是科研工作者的首要任務(wù)。 基于上述考慮,本論文主要就是探索新的生物傳感方法,用于DNA和蛋白質(zhì)的定性、定量分析。生物傳感器是利用生物活性物質(zhì)(核酸、蛋白質(zhì)、酶、細胞等)之間的分子識別功能,把被檢測的靶物質(zhì)的濃度變化、構(gòu)象變化等微觀的生物過程轉(zhuǎn)變成可視的、可量化的物理化學信號(如電信號、熒光信號),從而達到檢測靶分子(核酸、蛋白質(zhì)等)的目的。設(shè)計生物傳感器,重點是如何選擇最適合的與待測物特異性識別的敏感元件,這直接決定傳感器選擇性好壞和靈敏度高低,抗原-抗體、酶-基質(zhì)和核酸適體-蛋白質(zhì)都是很好的候選組合。生物傳感器的種類很多,比如酶傳感器、葡萄糖傳感器、免疫傳感器等。生物傳感方法作為生物技術(shù)中一種優(yōu)越的監(jiān)測手段和檢測方法,具有很好的應(yīng)用價值和發(fā)展空間。本課題主要研究了基于熒光探針和核酸適體的生物傳感器,并應(yīng)用到核酸和蛋白質(zhì)的分析與檢測方面。為此主要開展了以下幾個方面的工作： 1.主要研究小分子熒光探針(芘衍生物)與核酸分子的相互作用,分別考察了核酸濃度、核酸長度、核酸構(gòu)象(單鏈、雙鏈)對芘探針激基締合物熒光的影響。將核酸與芘探針之間作用的結(jié)果轉(zhuǎn)化為可視的熒光信號。旨在建立一種基于非標記(label-free)熒光探針的生物傳感器,用于探針核酸的存在以及核酸的不同構(gòu)象。 2.進一步研究芘熒光探針與正常和突變DNA分子的相互作用,引入一種單鏈核酸酶(nuclease SI),將因突變產(chǎn)生的單鏈DNA酶解成單核苷酸,而正常DNA免于酶切。酶切反應(yīng)后造成正常與突變核酸長度的差異,將這種長度差異轉(zhuǎn)化為芘探針激基締合物熒光差異。本實驗旨在建立一種DNA熱力學分析和酶切反應(yīng)的非標記(label-free)熒光生物傳感器,用于檢測核酸中單個堿基突變,即單核苷酸多態(tài)性分析。 3.主要研究蛋白質(zhì)與核酸適配體以及分子信標之間的相互作用。目的蛋白與單鏈結(jié)合蛋白(SSB)都能結(jié)合核酸適配體,但是,SSB競爭不過目的蛋白,被競爭下來的SSB與分子信標結(jié)合使其熒光恢復。本實驗旨在發(fā)展一種基于核酸適體-蛋白質(zhì)識別作用和蛋白質(zhì)競爭取代機制的生物傳感器,借助分子信標作為報告探針,用于分析蛋白質(zhì)含量,比如唾液中溶菌酶的含量。 4.主要研究單鏈結(jié)合蛋白(SSB)與分子信標的相互作用及SSB的循環(huán)過程。微量的SSB蛋白與分子信標結(jié)合后產(chǎn)生的熒光幾乎看不到,但是,當加入與分子信標末端互補的鎖定核酸(LNA)引物、聚合酶和dNTP,隨后的聚合反應(yīng)將把結(jié)合在信標上的SSB競爭下來,SSB再繼續(xù)打開剩余的分子信標,如此循環(huán)直到打開所有分子信標,并產(chǎn)生明顯可見的熒光信號。本實驗旨在發(fā)展一種基于分子信標探針及酶聚合反應(yīng)的熒光信號放大的生物傳感器,用于分析微量的單鏈結(jié)合蛋白(SSB)。 在進行核酸識別與檢測研究中,我們選擇一種芘衍生物作為熒光探針作為給信號的物質(zhì),這種芘探針本質(zhì)是一種多聚陽離子,能夠在DNA磷酸骨架(帶負電荷)表面自組裝并集聚產(chǎn)生激基締合物熒光(excimer emission)。深入研究發(fā)現(xiàn),核酸的構(gòu)象、核酸的濃度、核酸的長度直接影響到激基締合物熒光的產(chǎn)生和強度大小�；谶@些性質(zhì),我們設(shè)計了檢測點突變的熒光探針生物傳感器。 在進行蛋白質(zhì)識別與檢測研究中,我們的研究思路的是利用核酸適配體與蛋白質(zhì)特異性識別的原理來定量分析蛋白質(zhì)。其中,選擇了分子信標這種特殊的“光開關(guān)”作為給信號的報告探針。我們還引入了一種能循環(huán)使用的單鏈結(jié)合蛋白(SSB), SSB與分子信標的結(jié)合能夠使其猝滅的熒光信號得以恢復。根據(jù)這些原理,設(shè)計了基于溶菌酶-SSB競爭取代和SSB循環(huán)-分子信標信號擴增的實驗,結(jié)果表明,該方法可以用于SSB蛋白檢測。 通過系統(tǒng)全面的考察,我們已經(jīng)建立了上述四種生物傳感器,并且應(yīng)用到了核酸識別、點突變檢測、蛋白質(zhì)定量等方面。熒光探針法體現(xiàn)了免標記、成本低、快速的優(yōu)點�；诤怂徇m體的方法體現(xiàn)了高特異性和選擇性的優(yōu)點。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：吉林大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2011
【分類號】：R341

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 徒永華;程圭芳;林莉;鄭靜;吳自榮;何品剛;方禹之;;基于核酸適配體的新型熒光納米生物傳感器用于凝血酶的測定[J];高等學�；瘜W學報;2006年12期

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本文編號：1659084