本文選題：自然殺傷細胞　切入點：穿孔素　出處：《華中科技大學》2011年博士論文

【摘要】：一、前言 自然殺傷細胞(natural killer cell, NK cell)是固有免疫系統(tǒng)的重要組分,其通過釋放胞毒效應分子(穿孔素、顆粒酶等)而殺傷畸變的自身細胞及感染病原體的靶細胞。NK細胞無需致敏即能直接殺傷靶細胞,并可連續(xù)殺傷多個靶細胞。目前尚不清楚,NK細胞每次殺傷過程中所釋放胞毒效應分子的量,及其連續(xù)殺傷過程中通過何種機制不斷補充自身“彈藥庫”以維持“戰(zhàn)斗力”。理論上,NK細胞可不斷合成新的效應分子,但該過程涉及效應分子的糖基化修飾、剪切、構(gòu)象改變,最后進入分泌性溶酶體,全程需數(shù)小時。因此,探討NK細胞持續(xù)性殺傷過程中合成和儲備胞毒效應分子的確切機制,有助于從新的角度闡明NK細胞殺傷功能的機制。 免疫突觸與神經(jīng)突觸有諸多相似之處。文獻報道,神經(jīng)突觸胞吐后可發(fā)生有效的補償性內(nèi)吞,此對于維持突觸功能具有重要意義。神經(jīng)突觸內(nèi)分泌性囊泡與細胞膜融合后,包括膜蛋白的多種分子可迅速回收至神經(jīng)細胞內(nèi),其生物學意義為：減少胞吐所致細胞膜表面積增大；回收的膜蛋白可參與形成新的分泌囊泡,從而有利于神經(jīng)突觸適應不斷發(fā)放的神經(jīng)沖動。除膜蛋白外,神經(jīng)細胞還可回收可溶性神經(jīng)遞質(zhì)。近年文獻(包括本課題組前期研究)報道,免疫突觸中存在雙向運輸?shù)妮d體,也具有回收存儲胞毒效應分子的分泌性溶酶體膜蛋白的能力。深入探討胞毒效應分子的回收作用,有助于揭示細胞毒性T細胞(cytotoxic T lymphocyte, CTL)和NK細胞持續(xù)性殺傷作用的機制。 穿孔素是一類重要的胞毒效應分子,在NK細胞殺傷靶細胞過程中發(fā)揮重要作用,本文擬在課題組前期研究基礎(chǔ)上,探討NK細胞回收穿孔素的作用,并闡明其機制及生物學意義。 早期內(nèi)體是細胞回收細胞外物質(zhì)的最初細胞器,早期內(nèi)體體積增大提示外源性物質(zhì)的進入。本實驗用熒光標記的轉(zhuǎn)鐵蛋白作為示蹤分子,觀察其被NK92細胞內(nèi)吞后的定位。轉(zhuǎn)鐵蛋白內(nèi)吞后進入早期內(nèi)體,導致后者體積顯著增大,可作為細胞發(fā)生內(nèi)吞的指標。此外,與早期內(nèi)體共定位也表明內(nèi)吞的分子已進入早期內(nèi)體。 通過觀察NK92細胞早期內(nèi)體,判斷NK92細胞被靶細胞刺激后是否發(fā)生胞吞,結(jié)果發(fā)現(xiàn)：NK92細胞受靶細胞刺激15分鐘后,其早期內(nèi)體比對照組明顯增大,提示NK92細胞發(fā)生內(nèi)吞。 乙二醇四醋酸[Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid, EGTA]可抑制NK92細胞胞吐,但并不影響NK92細胞與靶細胞間形成免疫突觸。為探討內(nèi)吞發(fā)生的時相,我們在NK92細胞與靶細胞接觸過程中加入EGTA,發(fā)現(xiàn)可顯著抑制早期內(nèi)體增大。提示NK細胞內(nèi)吞繼發(fā)性于胞吐之后。 我們還發(fā)現(xiàn),靶細胞刺激NK92細胞15分鐘,穿孔素與早期內(nèi)體出現(xiàn)明顯共定位現(xiàn)象,而未受刺激的NK92細胞無此現(xiàn)象。另外,加入EGTA同樣可抑制穿孔素與早期內(nèi)體共定位。上述結(jié)果表明,NK92細胞殺傷靶細胞過程中出現(xiàn)穿孔素內(nèi)吞,該效應繼發(fā)于胞吐。 首先應用放線菌酮抑制新蛋白質(zhì)合成,以避免新生成的穿孔素干擾實驗結(jié)果。繼而應用針對不同胞吞途徑的抑制劑,探討NK92細胞內(nèi)吞作用的機制。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：應用針對clathrin途徑的抑制劑后,受靶細胞刺激的NK92細胞內(nèi)其穿孔素水平明顯降低(與未用抑制劑的NK92細胞相比)；應用針對脂筏和胞飲途徑的抑制劑并不影響胞內(nèi)穿孔素水平。提示：穿孔素內(nèi)吞效應為clathrin途徑依賴性,脂筏和胞飲途徑介導的內(nèi)吞不參與穿孔素回收。 借助共聚焦顯微鏡進一步證實穿孔素循clathrin內(nèi)吞途徑被回收,結(jié)果發(fā)現(xiàn)：在針對clathrin內(nèi)吞途徑的化學抑制劑作用下,NK92細胞受靶細胞刺激后,穿孔素和早期內(nèi)體無共定位。另外,應用更具特異性的小干擾RNA(small interfering RNA,siRNA)證實穿孔素回收途徑：用針對clathrin重鏈(clathrin heavy chain,CHC)的siRNA干擾NK92細胞clathrin表達,48小時后,靶細胞刺激并不導致穿孔素和早期內(nèi)體共定位；而用針對無關(guān)序列的siRNA干擾NK92細胞48小時,受靶細胞刺激后,穿孔素和早期內(nèi)體出現(xiàn)明顯共定位。由此證實,穿孔素可以由clathrin內(nèi)吞途徑介導進入早期內(nèi)體。 用針對clathrin內(nèi)吞途徑的抑制劑阻斷穿孔素回收,檢測對NK92細胞殺傷靶細胞功能的影響：效應細胞與靶細胞比例為5：1和10：1,檢測NK92細胞對原代豬內(nèi)皮細胞(Primary porcine endothelial cells,PEC)和人紅白血病細胞株(Humanerythroleukemia cell line,K562)的殺傷率；應用clathrin內(nèi)吞途徑抑制劑,NK92細胞對靶細胞殺傷率明顯低于對照組；用針對CHC的siRNA干擾NK92細胞(48h),導致后者對靶細胞殺傷率明顯降低(用針對無關(guān)序列的siRNA干擾作為對照)。 為探討clathrin途徑依賴的胞吞在NK92細胞持續(xù)性殺傷靶細胞中的作用,將效應細胞與靶細胞比例設為1：2和1：5,檢測不同時間點NK92細胞對靶細胞(PEC和K562)的殺傷率。與上述結(jié)果相印證,在效靶細胞比例倒置的情況下,NK92細胞對靶細胞的殺傷率隨殺傷時間延長而逐步增高；抑制clathrin途徑的內(nèi)吞(化學抑制劑和siRNA)后,NK92細胞對靶細胞的殺傷率低于對照(未抑制clathrin途徑)。 為觀察原代NK細胞是否也存在類似現(xiàn)象,用磁珠分離新鮮人外周血NK細胞(純度95%),用靶細胞刺激NK細胞15分鐘,穿孔素與早期內(nèi)體出現(xiàn)明顯共定位現(xiàn)象,而靜息狀態(tài)下不發(fā)生此現(xiàn)象。同時,抑制clathrin介導的內(nèi)吞途徑,則NK細胞的殺傷功能降低。 上述結(jié)果表明,clathrin途徑介導的內(nèi)吞在NK細胞殺傷功能中發(fā)揮重要作用,其機制可能與抑制穿孔素等效應分子回收相關(guān)。 六、結(jié)論 NK細胞受靶細胞刺激后,穿孔素循clathrin途徑回收至早期內(nèi)體中。此效應可被clathrin途徑的化學抑制劑或特異性siRNA抑制,并導致NK細胞殺傷功能下降。提示：穿孔素回收對維持NK細胞殺傷功能具有重要意義。
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【學位授予單位】：華中科技大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2011
【分類號】：R392.1

【共引文獻】

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本文編號：1659056