本文選題：維甲酸受體α　切入點(diǎn)：全反式維甲酸　出處：《河北醫(yī)科大學(xué)》2012年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：目的：Krüppel樣因子4（Krüppel-like factor4，KLF4）是一種含有鋅指結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子，在多種組織和細(xì)胞中廣泛存在。在不同細(xì)胞內(nèi)環(huán)境中，KLF4作為一種基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄因子，可激活或抑制多種基因的轉(zhuǎn)錄并調(diào)節(jié)包括增殖、分化、發(fā)育、炎癥和凋亡在內(nèi)的多種細(xì)胞生物學(xué)過程。因此，KLF4基因的表達(dá)調(diào)節(jié)和功能改變是影響細(xì)胞生物學(xué)行為的重要因素之一。前期的研究表明，KLF4基因功能的調(diào)節(jié)是復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)過程，既可以通過轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行調(diào)節(jié)，又可以通過轉(zhuǎn)錄后翻譯修飾水平調(diào)節(jié)，后者包括磷酸化、乙�；�、蘇素化及泛素化等過程的調(diào)節(jié)。此外，大量實(shí)驗(yàn)證據(jù)表明，多種刺激因素均可影響細(xì)胞內(nèi)KLF4的水平，如血清饑餓、氧化應(yīng)激、血小板衍生生長因子-BB（platelet-derived growth factor-BB，PDGF-BB）、丁酸鹽、環(huán)孢素、硒、轉(zhuǎn)化生長因子β（transforming growthfactor-β，TGF-β）、干擾素-γ、環(huán)腺苷酸（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）和全反式維甲酸（all-trans retinoic acid，ATRA）。本室前期研究發(fā)現(xiàn)，ATRA除可誘導(dǎo)KLF4表達(dá)外，還可以促進(jìn)KLF4乙�；土姿峄揎�，進(jìn)而轉(zhuǎn)錄激活血管平滑肌細(xì)胞（vascular smooth muscle cell，VSMC）分化標(biāo)志基因SM22α和SM α-actin并促進(jìn)VSMC向分化表型轉(zhuǎn)化。此外，Owens等人發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子激活蛋白-1（transcription factor stimulatingprotein-1，Sp1）參與VSMC中Klf4基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)；Yang等人報(bào)道KLF4可通過自調(diào)控方式調(diào)節(jié)Klf4基因轉(zhuǎn)錄。 ATRA是膳食攝入維生素A的代謝產(chǎn)物，可通過結(jié)合其胞內(nèi)核受體RAR和RXR而直接調(diào)節(jié)下游靶基因轉(zhuǎn)錄并促進(jìn)VSMC分化。RAR可與靶基因啟動子區(qū)的維甲酸應(yīng)答元件（retinoic acid response element，RARE）直接結(jié)合而調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄。未結(jié)合配體的RAR往往與輔抑制子構(gòu)成轉(zhuǎn)錄抑制復(fù)合體而使基因沉默；結(jié)合配體后，RAR募集一系列輔轉(zhuǎn)錄激活因子從而激活下游基因的轉(zhuǎn)錄。此外，RAR還可通過與其他轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合而間接調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄，如RAR可通過與轉(zhuǎn)錄因子Sp1/Sp3或STAT5結(jié)合而間接結(jié)合在啟動子區(qū)的Sp1/Sp3或STAT5結(jié)合位點(diǎn)發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用。目前，RAR被認(rèn)為是治療VSMC增殖性疾病的重要靶分子。在臨床治療中，ATRA已經(jīng)成功的運(yùn)用于白血病、癌癥及動脈再狹窄和斑塊形成等疾病的治療。然而，ATRA誘導(dǎo)Klf4基因表達(dá)的分子機(jī)制目前仍不十分清楚。 本研究系統(tǒng)的探討了VSMC中ATRA信號在誘導(dǎo)Klf4基因轉(zhuǎn)錄過程中的作用及其分子機(jī)制。 方法：細(xì)胞培養(yǎng)，腺病毒及質(zhì)粒載體的構(gòu)建，定點(diǎn)突變，小干擾RNA轉(zhuǎn)染，RNA提取及定量RT-PCR分析，Western印跡分析，熒光素酶報(bào)告基因分析，染色質(zhì)免疫共沉淀分析，寡核苷酸pull-down分析，GSTpull-down分析，免疫共沉淀分析，BrdU摻入分析，細(xì)胞遷移分析，鬼筆環(huán)肽細(xì)胞骨架染色等。 結(jié)果： 1RARα介導(dǎo)ATRA誘導(dǎo)的Klf4基因表達(dá) ATRA通過與其受體RAR和RXR結(jié)合而發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)的作用。RAR有三種亞型：RARα、RARβ和RARγ，分別由不同的基因編碼。本部分研究證實(shí)RARα，而不是RARβ或RARγ，參與了ATRA誘導(dǎo)的Klf4基因表達(dá)。結(jié)果如下： 1.1ATRA以濃度和時(shí)間依賴性方式誘導(dǎo)KLF4和RARα表達(dá) 為了探討ATRA誘導(dǎo)KLF4與ATRA受體（RARα、RARβ和RARγ）表達(dá)之間的關(guān)系，我們首先應(yīng)用Western印跡分析方法檢測不同濃度ATRA刺激VSMC不同時(shí)間后，KLF4和三種RAR的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，ATRA可顯著誘導(dǎo)KLF4和RARα的表達(dá)，且呈劑量和時(shí)間依賴性。然而，ATRA刺激后，RARβ和RARγ表達(dá)水平無顯著變化。 1.2RARα介導(dǎo)ATRA誘導(dǎo)的Klf4基因表達(dá) 為了進(jìn)一步探尋介導(dǎo)ATRA誘導(dǎo)Klf4基因轉(zhuǎn)錄的核受體，我們應(yīng)用小干擾RNA（si-RARα，si-RARβ和si-RARγ）分別敲低三種內(nèi)源性RAR的表達(dá)。結(jié)果顯示，在敲低內(nèi)源性RARα的細(xì)胞中，ATRA對Klf4表達(dá)的誘導(dǎo)作用受到顯著抑制。用RARα選擇性抑制劑Ro41-5253抑制RARα活性后再用ATRA刺激VSMC，ATRA對Klf4表達(dá)的誘導(dǎo)作用受到部分抑制。此外，應(yīng)用腺病毒表達(dá)載體Ad-GFP-RARα在VSMC中過表達(dá)RARα可增強(qiáng)ATRA對Klf4表達(dá)的誘導(dǎo)作用。 為了探明RARα介導(dǎo)Klf4表達(dá)是否通過其激活Klf4啟動子的轉(zhuǎn)錄活性，應(yīng)用Klf4啟動子報(bào)告基因和RARα、RARβ和RARγ的表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染CHO-K1細(xì)胞后進(jìn)行熒光素酶活性分析。結(jié)果顯示，RARα過表達(dá)可顯著增強(qiáng)ATRA對Klf4啟動子的激活作用，Ro41-5253預(yù)處理減弱ATRA對Klf4啟動子的轉(zhuǎn)錄激活作用。以上結(jié)果表明，RARα介導(dǎo)ATRA對Klf4啟動子的轉(zhuǎn)錄激活。 1.3ATRA通過Klf4啟動子近端的三個(gè)GC盒調(diào)節(jié)KLF4基因表達(dá) 為了檢測Klf4啟動子中RARα的應(yīng)答元件，我們構(gòu)建了5’-端缺失的Klf4啟動子報(bào)告基因進(jìn)行熒光素酶報(bào)告基因分析。結(jié)果顯示，ATRA刺激后，Klf4啟動子近端區(qū)域（-179至+20）的轉(zhuǎn)錄激活作用最強(qiáng)，序列分析，發(fā)現(xiàn)該區(qū)域含有三個(gè)GC盒。為了證實(shí)這三個(gè)GC盒是否為ATRA誘導(dǎo)Klf4表達(dá)所必需，我們突變不同GC盒后進(jìn)行報(bào)告基因分析。結(jié)果顯示，單獨(dú)突變一個(gè)GC盒后，ATRA對Klf4啟動子的激活作用下降64-80%，突變兩個(gè)GC盒后對Klf4啟動子的誘導(dǎo)作用降低85%，同時(shí)突變?nèi)齻�(gè)GC盒則使ATRA失去對Klf4啟動子的激活作用。以上結(jié)果表明，Klf4啟動子近端的三個(gè)GC盒協(xié)同參與ATRA對Klf4基因的轉(zhuǎn)錄激活作用。 1.4RARα募集在Klf4啟動子近端GC盒上并促進(jìn)Klf4轉(zhuǎn)錄 染色質(zhì)免疫沉淀（chromatin immunoprecipitation， ChIP）結(jié)果顯示，ATRA顯著促進(jìn)RARα在Klf4啟動子近端的結(jié)合。寡核苷酸pull-down分析顯示，ATRA促進(jìn)RARα與含GC1/2和GC3盒序列的探針結(jié)合，GC盒突變阻斷RARα與該探針的結(jié)合。這些結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)，ATRA促進(jìn)RARα與Klf4啟動子近端GC盒結(jié)合。 為了明確RARα與Klf4啟動子結(jié)合是否影響Klf4啟動子的轉(zhuǎn)錄活性，用RARα表達(dá)質(zhì)粒和Klf4野生型及GC盒突變型啟動子報(bào)告基因共轉(zhuǎn)染CHO-K1細(xì)胞后進(jìn)行熒光素酶活性分析。結(jié)果顯示，RARα過表達(dá)可顯著增強(qiáng)ATRA對Klf4啟動子的激活，GC盒突變后RARα對Klf4啟動子的轉(zhuǎn)錄激活作用消失。以上結(jié)果表明，RARα以GC盒依賴性方式介導(dǎo)ATRA誘導(dǎo)的Klf4基因表達(dá)。 2KLF4、Sp1和YB1通過與GC盒結(jié)合而激活Klf4啟動子 研究表明，RAR可通過與其它轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合而以RARE非依賴性方式調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄。因此我們推測，RARα可能通過與一個(gè)或多個(gè)GC盒結(jié)合蛋白相互作用而調(diào)節(jié)Klf4轉(zhuǎn)錄。本部分研究結(jié)果顯示，ATRA可誘導(dǎo)KLF4、Sp1和Y-box結(jié)合蛋白1（Y-box binding protein1，YB1）與GC盒直接結(jié)合，RARα通過與KLF4、Sp1及YB1相互作用而調(diào)節(jié)Klf4轉(zhuǎn)錄。結(jié)果如下： 2.1ATRA促進(jìn)RARα與KLF4、Sp1及YB1相互作用 以往研究發(fā)現(xiàn)， KLF4和Sp1可與Klf4啟動子近端結(jié)合并調(diào)節(jié)Klf4基因轉(zhuǎn)錄。為了尋找新的介導(dǎo)ATRA激活Klf4轉(zhuǎn)錄的核因子，我們以生物素標(biāo)記的Klf4啟動子近端雙股核苷酸片段（-179至+20）為探針，從VSMC裂解液中親和純化與DNA結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子。結(jié)果顯示，經(jīng)ATRA刺激后，該探針可以沉淀出一種分子量為36kDa的蛋白。經(jīng)HCT質(zhì)譜分析及氨基酸序列比對顯示該蛋白為YB1。Co-IP分析結(jié)果顯示，ATRA促進(jìn)RARα與KLF4、Sp1及YB1的相互作用。采用過表達(dá)GFP-RARα的CHO-K1細(xì)胞裂解液進(jìn)行GST pull-down分析的結(jié)果顯示，GFP-RARα可與原核細(xì)胞表達(dá)的GST-KLF4、GST-Sp1及GST-YB1蛋白純品直接結(jié)合，ATRA增強(qiáng)其結(jié)合活性。 2.2RARα與KLF4、Sp1和YB1協(xié)同激活Klf4基因轉(zhuǎn)錄 寡核苷酸pull-down分析結(jié)果顯示，在經(jīng)ATRA處理的VSMC中，KLF4、Sp1和YB1均可與Klf4啟動子近端含GC盒（GC1/2或GC3）的序列結(jié)合；GC盒突變后，KLF4、Sp1和YB1與探針的結(jié)合活性消失。ChIP分析進(jìn)一步證實(shí)，ATRA刺激可促進(jìn)KLF4、Sp1和YB1在Klf4啟動子近端的聚集。為了探明RARα與KLF4、Sp1和YB1相互作用對Klf4啟動子活性的影響，，用Klf4啟動子報(bào)告基因及KLF4、Sp1、YB1和RARα表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染CHO-K1細(xì)胞進(jìn)行熒光素酶活性分析。結(jié)果顯示，單純過表達(dá)KLF4、Sp1或YB1，或同時(shí)過表達(dá)兩種或三種轉(zhuǎn)錄因子，均可增強(qiáng)Klf4啟動子的轉(zhuǎn)錄活性，當(dāng)同時(shí)表達(dá)4種轉(zhuǎn)錄因子并給予ATRA刺激后，Klf4啟動子的轉(zhuǎn)錄活性最強(qiáng)。以上結(jié)果表明，RARα通過與KLF4、Sp1及YB1相互作用而激活Klf4基因轉(zhuǎn)錄。 2.3KLF4、Sp1和YB1直接與GC盒結(jié)合并協(xié)同激活Klf4基因表達(dá) 為了檢測KLF4、Sp1和YB1是否與GC盒直接結(jié)合，我們分別用原核細(xì)胞表達(dá)的GST-KLF4、GST-Sp1、GST-YB1及GST-RARα蛋白純品進(jìn)行寡核苷酸pull-down分析。結(jié)果顯示，GST-KLF4、GST-Sp1及GST-YB1均可與含GC盒（GC1/2或GC3）序列的探針在體外直接結(jié)合，隨著探針濃度的增加其結(jié)合量增多；GC盒突變后則與探針的結(jié)合活性消失。此外，寡核苷酸pull-down試驗(yàn)不能觀察到GST-RARα與GC探針的結(jié)合。提示RARα可能通過間接方式與Klf4啟動子結(jié)合。 用Klf4啟動子報(bào)告基因及不同轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染CHO-K1細(xì)胞進(jìn)行熒光素酶活性分析。結(jié)果顯示，共轉(zhuǎn)染等量的Sp1及不同量的KLF4表達(dá)質(zhì)粒后，隨著KLF4表達(dá)量的增加，Sp1對Klf4啟動子的轉(zhuǎn)錄激活作用逐漸增強(qiáng)。同樣，共轉(zhuǎn)染等量的KLF4及不同量的Sp1表達(dá)質(zhì)粒，隨著Sp1表達(dá)量的增加，Klf4啟動子的活性亦增強(qiáng)。這些結(jié)果表明，KLF4和Sp1協(xié)同激活Klf4轉(zhuǎn)錄。此外，Sp1和YB1、以及YB1和KLF4都能協(xié)同激活Klf4基因轉(zhuǎn)錄。 2.4KLF4、Sp1和YB1與Klf4啟動子結(jié)合有賴于RARα的活化 應(yīng)用小干擾RNA技術(shù)敲低內(nèi)源性RARα表達(dá)后進(jìn)行ChIP分析的結(jié)果表明，ATRA促進(jìn)KLF4、Sp1和YB1在KLF4啟動子的結(jié)合；應(yīng)用si-RARα下調(diào)內(nèi)源性RARα表達(dá)可減小ATRA誘導(dǎo)的這些轉(zhuǎn)錄因子在Klf4啟動子的募集。以上結(jié)果表明，RARα配體化有助于KLF4、Sp1和YB1與Klf4啟動子GC盒結(jié)合。 3ATRA促進(jìn)RARα以KLF4-Sp1-YB1依賴性方式與Klf4啟動子結(jié)合 為了進(jìn)一步明確RARα介導(dǎo)Klf4轉(zhuǎn)錄的分子機(jī)制，我們進(jìn)一步研究ATRA對RARα和KLF4-Sp1-YB1復(fù)合體與Klf4啟動子結(jié)合的影響。結(jié)果如下： 3.1ATRA促進(jìn)RARα與KLF4-Sp1-YB1復(fù)合體的結(jié)合 GST pull-down分析結(jié)果顯示，在未給予ATRA刺激的VSMC中，KLF4、Sp1和YB1三者形成復(fù)合體；加入ATRA刺激后，RARα與KLF4-Sp1-YB1復(fù)合體結(jié)合活性增強(qiáng)。為了進(jìn)一步明確KLF4、Sp1和YB1之間存在相互作用，分別應(yīng)用轉(zhuǎn)染GFP-KLF4、GFP-Sp1和GFP-YB1的CHO-K1細(xì)胞裂解液與原核表達(dá)的GST-Sp1、GST-YB1和GST-KLF4蛋白純品進(jìn)行GST pull-down分析。結(jié)果顯示，KLF4-Sp1、KLF4-YB1及Sp1-YB1之間均可在體外直接結(jié)合。此外，我們也分析了ATRA刺激對KLF4、YB1及Sp1的其它靶基因表達(dá)的影響。結(jié)果顯示，ATRA刺激24小時(shí)后，VSMC中SM22α、p53和p21表達(dá)均顯著增高。 3.2ATRA促進(jìn)RARα以KLF4-Sp1-YB1依賴性方式與Klf4啟動子結(jié)合 為了明確RARα在Klf4啟動子上的募集是否依賴于KLF4-Sp1-YB1復(fù)合物與Klf4啟動子的結(jié)合，分別敲低內(nèi)源性KLF4、Sp1和YB1后，采用ChIP分析檢測RARα在Klf4啟動子的結(jié)合情況。結(jié)果顯示，ATRA處理使RARα在Klf4啟動子上的結(jié)合活性顯著增強(qiáng)；應(yīng)用si-RNA分別敲低內(nèi)源性KLF4、Sp1或YB1可顯著抑制RARα在Klf4啟動子的募集。此外，將KLF4、Sp1或YB1表達(dá)質(zhì)粒與RARα表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染CHO-K1細(xì)胞，以含GC1/2或GC3序列的寡核苷酸為探針進(jìn)行pull-down分析。結(jié)果顯示，單獨(dú)過表達(dá)RARα?xí)r，RARα與GC1/2或GC3探針的結(jié)合活性較低；共表達(dá)KLF4、Sp1或YB1可顯著增加RARα與GC探針的結(jié)合。以上結(jié)果提示，RARα與Klf4啟動子的結(jié)合是KLF4-Sp1-YB1依賴性的，ATRA刺激可促進(jìn)RARα與KLF4-Sp1-YB1復(fù)合體的結(jié)合。 3.3RARα通過KLF4、Sp1和YB1介導(dǎo)Klf4表達(dá) 應(yīng)用小干擾RNA敲低VSMC內(nèi)源性KLF4、Sp1和YB1，同時(shí)以腺病毒表達(dá)載體Ad-GFP-RARα感染VSMC，觀察ATRA刺激對Klf4表達(dá)的影響。結(jié)果顯示，過表達(dá)RARα可顯著促進(jìn)ATRA誘導(dǎo)的Klf4表達(dá)；敲低內(nèi)源性KLF4、Sp1和YB1的同時(shí)過表達(dá)RARα，則減弱了ATRA對Klf4表達(dá)的誘導(dǎo)作用。以上結(jié)果提示，KLF4、Sp1和YB1是RARα介導(dǎo)Klf4表達(dá)所必需的。 4YB1與GC盒結(jié)合并促進(jìn)VSMC分化 YB1是含冷休克結(jié)構(gòu)域（cold-shock domain，CSD）的蛋白家族成員之一，在基因轉(zhuǎn)錄、RNA剪切及mRNA翻譯等過程中均發(fā)揮重要作用。以往研究表明，YB1通過與含5’-CTGATTGG-3’基序（又稱為Y-盒）的雙鏈DNA（double-stranded DNA，ds-DNA）或富含C/T-或GC/GA-序列的單鏈DNA（single-stranded DNA，ss-DNA）結(jié)合而調(diào)控多種基因的轉(zhuǎn)錄。本部分研究首次報(bào)道，YB1可與含GGGCGG基序（GC盒）的雙鏈DNA直接結(jié)合，并進(jìn)一步探討了YB1與GC盒結(jié)合的分子機(jī)制及其在VSMC中的生物學(xué)效應(yīng)。 4.1YB1與GC盒直接結(jié)合 為了探討YB1與GC盒序列的結(jié)合活性，我們設(shè)計(jì)了幾種生物素標(biāo)記的含GC盒序列的雙鏈DNA探針進(jìn)行寡核苷酸pull-down分析，以含CACCC序列的探針或GC盒突變的探針作為陰性對照，以含Y-盒序列的探針及串聯(lián)的4×GC盒探針作為陽性對照。應(yīng)用VSMC全細(xì)胞裂解液、轉(zhuǎn)染GFP-YB1的A293細(xì)胞裂解液或原核表達(dá)的GST-YB1蛋白純品，與不同探針共孵育并進(jìn)行寡核苷酸pull-down分析，以檢測YB1與GC盒的結(jié)合活性。結(jié)果顯示，VSMC中的內(nèi)源性YB1、外源性過表達(dá)的GFP-YB1以及純化的GST-YB1，均可與含GC盒的幾種探針相結(jié)合，這些與YB1結(jié)合的探針包括位于VSMC分化相關(guān)基因（SM22α，p21）及增殖相關(guān)基因（cyclin D1）啟動子中的DNA元件；突變這些探針中的GC盒可阻斷其與YB1的結(jié)合。與YB1結(jié)合活性最強(qiáng)的探針為串聯(lián)的4×GC盒探針。以上結(jié)果表明，YB1可與GC盒直接并特異性結(jié)合。 4.2YB1與GC盒的結(jié)合不依賴其CSD或ss-DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域 為了檢測YB1分子中與GC盒特異性結(jié)合的區(qū)域，我們應(yīng)用生物素標(biāo)記的雙鏈探針a（SM22α啟動子）與等量的野生型或不同截短突變的GST-YB1蛋白純品體外共孵育，并進(jìn)行寡核苷酸pull-down分析。除與全長的野生型YB1相結(jié)合外，含GC盒的探針a也可結(jié)合YB1（1-220）、YB1（125-324aa）及YB1（125-220aa）。純化的YB1（125-220aa）可與探針a或串聯(lián)的4×GC盒探針體外直接結(jié)合，其結(jié)合量隨探針濃度的增加而增加。此外，在A293細(xì)胞中過表達(dá)GFP-YB1及GFP-YB1的不同截短突變體，應(yīng)用該細(xì)胞裂解液與GC盒探針共孵育進(jìn)行寡核苷酸pull-down分析；結(jié)果顯示，GFP-YB1、GFP-YB1（125-220aa）及GFP-YB1（125-324aa）可與GC盒相結(jié)合。以上結(jié)果表明，YB1與GC盒的結(jié)合不依賴其N-端的CSD（65-125aa）或ss-DNA結(jié)合區(qū)域（15-71aa），YB1分子中125-220氨基酸序列是其與GC盒結(jié)合所必需的。 此外，為了比較YB1與ds-DNA或ss-DNA的親和力，應(yīng)用生物素標(biāo)記的ds-GC或ss-GC作為探針，與GST-YB1或GST-YB1（125-220aa）蛋白純品，或過表達(dá)GFP-YB1或GFP-YB1（125-220aa）的A293細(xì)胞裂解液共孵育，并進(jìn)行寡核苷酸pull-down分析。結(jié)果顯示，全長的GST-YB1或GFP-YB1可結(jié)合ds-GC和ss-GC，而缺失ss-DNA結(jié)合區(qū)域（15-71aa）的截短突變體GST-YB1（125-220aa）或GFP-YB1（125-220aa）則只結(jié)合ds-GC探針。這些結(jié)果進(jìn)一步提示，YB1分子中125-220位氨基酸序列決定YB1與GC盒的結(jié)合活性。 4.3YB1C-端功能域促進(jìn)VSMC分化 為了明確含有GC盒結(jié)合區(qū)域的YB1分子C-端（125-324aa）是否還能參與GC盒依賴性靶基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)，應(yīng)用SM22α或p21啟動子報(bào)告基因及GFP-YB1或GFP-YB1（125-324aa）表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染VSMC后進(jìn)行熒光素酶活性分析。結(jié)果顯示，YB1C-端過表達(dá)可顯著增強(qiáng)SM22α和p21啟動子的轉(zhuǎn)錄活性。此外，我們構(gòu)建了編碼GFP-YB1或GFP-YB1C-端氨基酸序列的腺病毒表達(dá)載體，感染VSMC72小時(shí)后進(jìn)行鬼筆環(huán)肽染色，激光共聚焦顯微鏡下觀察YB1或YB1C-端過表達(dá)對VSMC細(xì)胞骨架形態(tài)的影響。結(jié)果顯示，全長的YB1蛋白在VSMC胞漿和胞核均有分布，并在核周呈顆粒樣聚集；而YB1C-端主要定位在胞核中。鬼筆環(huán)肽染色顯示，YB1過表達(dá)使VSMC肌絲變得粗大、排列整齊；YB1C-端過表達(dá)后，VSMC形態(tài)明顯伸長，并形成許多粗大的、沿細(xì)胞長軸平行排列的應(yīng)力纖維。提示YB1C-端可促進(jìn)VSMC向分化表型轉(zhuǎn)化。 為了進(jìn)一步驗(yàn)證YB1C-端（125-324aa）在VSMC分化中的作用，應(yīng)用腺病毒表達(dá)載體Ad-GFP、Ad-GFP-YB1或Ad-GFP-YB1（125-324aa）感染VSMC72小時(shí)并進(jìn)行Western blot分析。與Ad-GFP感染組相比，GFP-YB1C-端（125-324aa）過表達(dá)可顯著上調(diào)VSMC中SM22α和p21的蛋白表達(dá)水平，同時(shí)下調(diào)增殖相關(guān)基因PCNA的表達(dá)水平，進(jìn)一步提示了YB1C-端具有促進(jìn)VSMC分化并抑制增殖的作用。BrdU摻入分析顯示，應(yīng)用小干擾RNA敲低內(nèi)源性YB1表達(dá)后，VSMC中BrdU相對摻入率增加；當(dāng)過表達(dá)YB1或其C-端功能域后，VSMC中BrdU相對摻入率則受到顯著抑制。提示YB1及其C-端功能域發(fā)揮抑制VSMC增殖的作用。 由于YB1及其C-端功能域過表達(dá)可影響VSMC細(xì)胞骨架的形態(tài)，因此我們進(jìn)一步檢測了YB1對VSMC遷移能力的影響。應(yīng)用si-YB1敲低內(nèi)源性YB1，或Ad-GFP-YB1及Ad-GFP-YB1（125-324aa）感染VSMC后，進(jìn)行Boyden小室或傷口愈合實(shí)驗(yàn)分析YB1對VSMC跨膜和平面遷移能力的影響。結(jié)果顯示，敲低內(nèi)源性YB1表達(dá)可增強(qiáng)VSMC的遷移能力；而過表達(dá)YB1或其C-端功能域可顯著抑制VSMC的遷移能力。以上結(jié)果提示，YB1C-端功能域在YB1誘導(dǎo)VSMC分化過程中發(fā)揮重要作用。 結(jié)論：1ATRA誘導(dǎo)VSMC中KLF4和RARα表達(dá)，RARα通過與Klf4啟動子中GC盒結(jié)合介導(dǎo)ATRA誘導(dǎo)的Klf4基因表達(dá)。2ATRA促進(jìn)RARα與KLF4、Sp1及YB1相互作用，KLF4、Sp1和YB1通過與GC盒直接結(jié)合而增強(qiáng)Klf4啟動子活性。3ATRA促進(jìn)RARα以KLF4-Sp1-YB1依賴性方式結(jié)合Klf4啟動子，KLF4、Sp1和YB1是RARα介導(dǎo)Klf4表達(dá)所必需的。4YB1與GC盒直接結(jié)合并促進(jìn)VSMC分化。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號】：R346

【參考文獻(xiàn)】

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1 孫中書;曾義;韓楊云;龍曉東;游潮;;全反式維甲酸誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲相關(guān)基因的差異表達(dá)[J];四川醫(yī)學(xué);2008年10期

本文編號：1652886