本文選題：CD59　切入點：CD3　出處：《青島大學(xué)》2012年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：目的：采用前期已構(gòu)建的CD59pSUPER-RNAi質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Jurkat細(xì)胞,探討特異性沉默CD59前后CD59對CD3介導(dǎo)Jurkat細(xì)胞活化信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的相關(guān)作用。方法：應(yīng)用Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染病毒包裝細(xì)胞系PA317,然后收集病毒的上清感染Jurkat細(xì)胞,經(jīng)G418壓力篩選建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系,利用RT-PCR檢測轉(zhuǎn)染后CD59在基因水平的表達(dá)抑制效果。實驗分為未轉(zhuǎn)染的Jurkat細(xì)胞組,轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒pSUPER組和轉(zhuǎn)染CD59pSUPER-RNAi質(zhì)粒的Jurkat細(xì)胞組,采用噻唑藍(lán)(MTT)比色法、Western Blot技術(shù)和激光共聚焦顯微鏡來分別檢測交聯(lián)CD59單抗與固相化CD3單抗聯(lián)合作用后對三組細(xì)胞的細(xì)胞增殖效應(yīng)、ZAP-70酪氨酸的磷酸化水平以及細(xì)胞漿內(nèi)鈣離子的變化水平。結(jié)果：重組干擾載體轉(zhuǎn)染后,經(jīng)G418壓力篩選得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系,且RT-PCR結(jié)果表明轉(zhuǎn)染CD59pSUPER-RNAi質(zhì)粒的Jurkat細(xì)胞組CD59分子的表達(dá)被抑制。轉(zhuǎn)染干擾質(zhì)粒Jurkat細(xì)胞組CD59與CD3聯(lián)合作用后細(xì)胞增殖能力、ZAP-70酪氨酸磷酸化水平以及胞內(nèi)鈣離子濃度均明顯低于未轉(zhuǎn)染組與轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組(P0.05)；但未轉(zhuǎn)染組和轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組之間無差異。結(jié)論：CD59對CD3介導(dǎo)T細(xì)胞活化信號轉(zhuǎn)導(dǎo)有增強效應(yīng)。 目的：采用RNAi技術(shù)構(gòu)建并篩選攜帶針對CD3ξ基因的pSUPER-RNAi逆轉(zhuǎn)錄病毒載體以及穩(wěn)定產(chǎn)毒的細(xì)胞克隆。方法：應(yīng)用DNA重組技術(shù),設(shè)計三條60bp可轉(zhuǎn)錄生成靶向CD3ξ小發(fā)卡RNA (shRNA)的寡核苷酸序列,并以pSUPER.retro.neo+gfp質(zhì)粒作為空載體,經(jīng)過限制性核酸內(nèi)切酶酶切后與設(shè)計序列進(jìn)行重組,以構(gòu)建CD3ζ pSUPER-RNAi逆轉(zhuǎn)錄病毒載體,用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞系PA317,建立產(chǎn)生逆轉(zhuǎn)錄病毒的細(xì)胞克隆。結(jié)果：重組載體經(jīng)過限制性核酸內(nèi)切酶酶切、PCR和基因測序鑒定證實CD3ζ pSUPER-RNAi重組質(zhì)粒構(gòu)建成功；脂質(zhì)體法把重組載體轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞系PA317,鏡下觀察可表達(dá)綠色熒光蛋白,表明包裝成功。結(jié)論：本實驗成功地構(gòu)建了特異性沉默CD3ξ基因的pSUPER-RNAi逆轉(zhuǎn)錄病毒載體以及穩(wěn)定產(chǎn)毒的細(xì)胞系,為后續(xù)研究CD59與CD3ξ在T細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的相互作用提供理論和實驗依據(jù)。 目的：將前期構(gòu)建好的pSUPER-CD3ζNAi與pSUPER-CD59RNAi真核表達(dá)載體于Jurkat細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá),研究CD59與CD3分子在T細(xì)胞活化信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的相互作用,從而探討CD59向T細(xì)胞內(nèi)傳遞信號的相關(guān)機制。方法：收集病毒上清,然后感染Jurkat細(xì)胞,經(jīng)過G418壓力篩選建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系,利用RT-PCR檢測轉(zhuǎn)染后CD3ξ在mRNA水平的表達(dá)抑制效果；利用噻唑藍(lán)(MTT)比色法檢測轉(zhuǎn)染重組載體前后各組Jurkat細(xì)胞的增殖效應(yīng)；采用Western Blot技術(shù)檢測各組Jurkat細(xì)胞的ZAP-70酪氨酸磷酸化的水平；利用激光共聚焦顯微鏡檢測各組細(xì)胞胞漿內(nèi)Ca2+的變化；應(yīng)用ELISA檢測細(xì)胞上清中白介素2(IL-2)的變化水平,比較各組差異。結(jié)果：RT-PCR結(jié)果表明重組載體轉(zhuǎn)染后CD3ξ基因表達(dá)受抑制,且3條干擾序列中有2條可以明顯抑制CD3ξ基因的表達(dá)(siCD3ζ-R2and siCD3ζ-R3),其中siCD3ζ-R2和siCD3ζ-R3組mRNA的表達(dá)分別降低到42.71%(P0.01)和47.52%(P0.01)。轉(zhuǎn)染干擾質(zhì)粒的細(xì)胞組在聯(lián)合作用后其細(xì)胞增殖能力,ZAP-70酪氨酸磷酸化水平,鈣離子濃度及IL-2變化均明顯低于未轉(zhuǎn)染組與空質(zhì)粒組,其差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),并且轉(zhuǎn)染CD3ζNAi質(zhì)粒組低于轉(zhuǎn)染CD59RNAi質(zhì)粒組,兩組細(xì)胞比較其差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05) 結(jié)論：CD59和CD3在T細(xì)胞活化信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中存在協(xié)同作用,且CD59可借助CD3ξ向胞內(nèi)傳遞信號。
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【學(xué)位授予單位】：青島大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號】：R392.11

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前5條

1 石學(xué)香;高美華;臧金林;;人CD59 RNAi逆轉(zhuǎn)錄病毒載體系統(tǒng)的構(gòu)建與鑒定[J];青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院學(xué)報;2009年01期

2 王娟;高美華;張蓓;;CD59錨定蛋白對CD3介導(dǎo)Jurkat細(xì)胞活化信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中的增強效應(yīng)[J];免疫學(xué)雜志;2011年11期

3 王文舉;李鴻鈞;孫茂盛;;脂筏與T細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[J];生命科學(xué);2007年05期

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本文編號：1649205