本文選題：逆轉(zhuǎn)錄病毒載體法　切入點：誘導性多潛能干細胞　出處：《南京醫(yī)科大學》2011年碩士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：2006年,Yamanaka等系統(tǒng)研究小鼠和人胚胎干細胞(Embryonic Stem Cells,ES)多能性相關因子時發(fā)現(xiàn)4個轉(zhuǎn)錄因子:Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc(OSKM)可以成功將成纖維細胞重編程為ES樣細胞,稱之為誘導多能干細胞(induced Pluripotent Stem cells, iPS細胞),該細胞在形態(tài)、多能性維持和分化潛能上與胚胎干細胞一致,且避免了倫理學爭議和異體細胞移植排斥等問題[1, 2]。因此,iPS細胞已代替ES細胞在疾病模型、毒理學研究、藥物敏感性篩選、替代治療等方面發(fā)揮重要作用。本文目的之一是借鑒國內(nèi)外通行的技術,在本學科的干細胞中心建立人真皮成纖維細胞的iPS細胞,并對方法進行優(yōu)化。其次,對于iPS冷凍保存,同ES一樣,目前還沒有非常有效或者標準化的冷凍保存技術。當前廣泛采用的“慢凍-快融法”冷凍保存技術,在應用于iPS細胞時存在著復蘇效率低下、解凍后大量克隆團塊死亡或自發(fā)分化的問題。因此,本文第二部分的工作是研究一種簡單、經(jīng)濟、實用、有效的冷凍保存及復蘇方法,以滿足iPS的冷凍保存和研究的需要。 目的: 1)建立兩種類型的人成體細胞系:真皮成纖維細胞和毛囊細胞細胞系,借助逆轉(zhuǎn)錄病毒載體法將Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc四種基因?qū)氤衫w維細胞,進而將其重編程為iPS細胞。建立該技術平臺,為本學科開展iPS細胞相關研究及應用奠定了基礎。 2)建立和研究麥管玻璃化法冷凍保存人誘導多能干細胞的方法,并進行可行性評估。 方法: 一、逆轉(zhuǎn)錄病毒介導的人誘導多能干細胞建系方法的相關研究 1.獲得兩種人成體細胞 簽署知情同意后,采用標準消化法從外科手術時切除的患者皮膚中獲得人皮膚成纖維細胞和拔取的含完整根鞘的毛囊在神經(jīng)干細胞培養(yǎng)液貼壁生長獲得毛囊細胞。 2.逆轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒鑒定? 逆轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒pMX-hOCT4,pMX-hSOX2,pMX-hKLF4,pMX-hc-Myc, pMX-GFP系統(tǒng)經(jīng)過轉(zhuǎn)化擴增酶切鑒定,OCT4經(jīng)Xho I、pMX-hSOX2,pMX-hKLF4,及pMX-hc-Myc經(jīng)Not I進行酶切,產(chǎn)物用2%的瓊脂糖凝膠電泳。? 3. pMX逆轉(zhuǎn)錄病毒系統(tǒng)生產(chǎn)及感染能力鑒定 按脂質(zhì)體介導的瞬時轉(zhuǎn)染標準方法,用PLAT A細胞包裝pMX-GFP病毒,48h后觀察綠色熒光;用病毒上清感染成纖維細胞,24~48h后熒光顯微鏡下觀察綠色熒光,并以流式細胞儀檢測感染效率。 4.逆轉(zhuǎn)錄病毒載體法重編程成體細胞為iPS細胞 用1:1:1:1的OSKM混合逆轉(zhuǎn)錄病毒感染提前24h準備的細胞總數(shù)為1x105的人成纖維細胞,同時采用pMX-GFP病毒感染相同數(shù)目的體細胞作用感染效果指示,并選用10ng/ml聚凝胺增加感染效率;24小時后重復一次,可重復3次。最后一次重復24小時后轉(zhuǎn)移感染后細胞到飼養(yǎng)層細胞上,24小時后換成ES培養(yǎng)液,之后每天更換培養(yǎng)液,觀察細胞形態(tài)變化并記錄第一個克隆出現(xiàn)時間,直到第二十天克隆足夠大時挑克隆擴大培養(yǎng)。 5.人iPS的特性鑒定 原代克隆行AKP染色和TRA-1-81活細胞染色鑒定;iPS細胞系傳代培養(yǎng)至第10代后,進行核型分析;通過RT-PCR法和間接免疫熒光法檢測人ES細胞標志性基因表達;檢測OCT4啟動子在誘導前后的甲基化表達變化;懸浮培養(yǎng)觀察擬胚體形成及分化情況;iPS細胞接種至SCID小鼠皮下,觀察畸胎瘤形成情況。 二、麥管玻璃化法冷凍人iPS細胞 將機械法切割的HDF-iPS細胞團塊,依次在10%玻璃化冷凍液和20%玻璃化冷凍液中處理后保存于20%的冷凍液中,封裝于0.25mL麥管并快速置于液氮中保存。解凍時將iPS團塊依次置入0.2M蔗糖溶液和0.1M蔗糖溶液后,接種至飼養(yǎng)層上培養(yǎng)。檢測復蘇效率,并對解凍后長期培養(yǎng)的iPS細胞進行特性鑒定,包括:堿性磷酸酶染色、OCT4等多能因子免疫熒光染色、RT-PCR法檢測內(nèi)源性干細胞因子Oct4和Sox2的表達、擬胚體分化、神經(jīng)細胞分化和畸胎瘤分化能力檢測等。 結(jié)果: 一、人誘導多能干細胞系的建立 1.獲得兩種人成體細胞:采用標準消化法從外科手術時切除皮膚中獲得人皮膚成纖維細胞,成長梭狀,生長迅速,可穩(wěn)定傳代及冷凍保存;直接拔取的含完整根鞘的毛囊在神經(jīng)干細胞培養(yǎng)液中貼壁生長獲得呈橢圓形,聚集生長的毛囊細胞。 2.逆轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)化后酶切,產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳均可見預期大小的條帶。 3.pMX逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝及鑒定:由于PMX-OSKM無GFP指示,以攜帶EGFP基因的pMX-GFP作為陽性參照,將pMX-GFP以脂質(zhì)體2000瞬時穩(wěn)定轉(zhuǎn)染PLAT A細胞,48h后倒置熒光顯微鏡下可見綠色熒光,預示轉(zhuǎn)染成功。 4.利用細胞模型在體外驗證pMX逆轉(zhuǎn)錄病毒系統(tǒng)能否正常表達:用攜帶EGFP基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒感染成纖維細胞,48h后在倒置熒光顯微鏡下觀察到綠色熒光,這表明轉(zhuǎn)基因EGFP在成纖維細胞內(nèi)能夠正常表達。流式細胞儀可檢測到pMX-GFP感染成纖維細胞效率為81.4%。 5.逆轉(zhuǎn)錄病毒載體法重編程成纖維細胞為iPS細胞:病毒感染后第4天開始可見到明顯細胞形狀改變,長梭狀明顯縮短并逐漸聚集生長,第14天可見ESC樣克隆出現(xiàn),第20天克隆足夠大可以挑克隆以擴大培養(yǎng)。 6.iPS細胞生物學特性鑒定: (1)第20天時堿性磷酸酶染色和活細胞多能因子TRA-1-81染色陽性; (2)具有典型的ES細胞克隆形態(tài),具有正常二倍體核型,誘導后OCT4啟動子表現(xiàn)為高度去甲基化; (3)表達ES細胞特有的標志性基因; (4)具有體外分化形成囊性擬胚體的能力,和在SCID鼠體內(nèi)形成畸胎瘤的能力。 二、玻璃化冷凍及玻璃化解凍HDF-iPS 解凍后,可見部分細胞團塊24小時內(nèi)貼壁生長,部分則完全松散解離不能貼壁而死亡,麥管玻璃化法冷凍保存的iPS細胞解凍后復蘇率可達77.4±13.12 %,慢凍-快融復蘇率為25.8±10.64%(n=4);方差分析, p0.01,兩者有顯著性差異。解凍后iPS長期傳代培養(yǎng)仍能維持其特性:堿性磷酸酶陽性,OCT4、SOX2、NANOG、SSEA4、TRA-1-60免疫染色陽性,RT-PCR可檢測到內(nèi)源性oct4和sox2的表達,核型檢測未見異常改變。具備EB、神經(jīng)細胞和畸胎瘤分化能力。體外在去除bFGF和飼養(yǎng)層后細胞后自發(fā)分化成EB, EB分化5天后轉(zhuǎn)至神經(jīng)前體細胞培養(yǎng)基,經(jīng)兩代以上的傳代和培養(yǎng)均獲得了均一的神經(jīng)前體細胞,細胞短小呈梭形,在PO/FN上呈克隆式生長,表達NESTIN,在撤除bFGF后,神經(jīng)前體細胞發(fā)生分化,在分化第11天時出現(xiàn)TuJ1陽性的神經(jīng)元,繼續(xù)分化4周后可見到分化的GFAP陽性的神經(jīng)膠質(zhì)細胞。 結(jié)論: 1.從人皮膚細胞及毛發(fā)中分別獲取成纖維細胞和毛囊細胞,并能運用Oct4、Klf4、c-Myc和Sox2四種基因成功將成纖維細胞重編程為iPS細胞。 2.所得iPS細胞系具有人ES細胞的一些生物學特性,且在體外長期傳代中能夠維持此特性,初步證明建立了人iPS細胞系。 3.麥管玻璃化冷凍技術可以有效保存iPS細胞,解凍后的iPS細胞在后續(xù)傳代培養(yǎng)中仍然保持其特性。 4.本課題引進和優(yōu)化了人iPS細胞的相關技術,為本學科開展iPS細胞研究及應用奠定了基礎。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：南京醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2011
【分類號】：R329

【參考文獻】

相關期刊論文 前4條

1 劉衛(wèi)生;王英杰;劉濤;張世昌;;模擬微重力條件下小鼠擬胚體形成及分化的初步觀察[J];第三軍醫(yī)大學學報;2008年17期

2 孫海翔;胡婭莉;陳林君;張寧媛;徐志鵬;;兩種不同玻璃化冷凍方案對小鼠卵母細胞紡錘體的影響[J];中華男科學雜志;2006年12期

3 李朋;胡洪亮;張玲玲;丁慧;張偉;田汝輝;劉平;史占平;郭熙志;李錚;黃翼然;;誘導多能干細胞體外向生精細胞自發(fā)分化潛能的研究[J];中華男科學雜志;2011年01期

4 周燦權,麥慶云,李濤,莊廣倫;Cryopreservation of human embryonic stem cells by vitrification[J];Chinese Medical Journal;2004年07期

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1 陳娟;人胚胎早期發(fā)育及人胚胎干細胞建系的初步研究[D];南京醫(yī)科大學;2004年

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本文編號：1646643