本文選題：P-選擇素　切入點(diǎn)：反應(yīng)動(dòng)力學(xué)　出處：《中山大學(xué)》2011年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：本論文以兩種分別參與體內(nèi)兩個(gè)重要細(xì)胞滾動(dòng)粘附過(guò)程的分子——P-選擇素(P-selectin)和血管性血友病因子(von Willebrand factor, VWF)分子作為研究對(duì)象,研究力(剪切力)調(diào)控下兩種分子的生物物理特性。VWF分子存在于血漿當(dāng)中,參與血小板在血管損傷部位的滾動(dòng)粘附和聚集,為血管修復(fù)的重要參與者,而不正常聚集也是誘發(fā)血栓形成的重要原因。研究力(剪切力)調(diào)控下這兩種分子的生物物理特性,對(duì)于進(jìn)一步了解炎癥反應(yīng)、止血、血栓形成等過(guò)程有十分重要的意義,同時(shí)也將為下一步制藥方面的應(yīng)用帶來(lái)一定的指導(dǎo)作用。在論文中,針對(duì)這兩種分子分別應(yīng)用了兩種不同的生物力學(xué)實(shí)驗(yàn)手段進(jìn)行研究:利用平行平板流動(dòng)腔(parallel plate flow chamber, PPFC)在不同剪切力條件下,研究HL-60細(xì)胞在P-選擇素上的滾動(dòng)粘附;利用光鑷(optical tweezers, OT)和微吸管(micropipette)組建的實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)研究VWF分子在恒速度拉伸下的解折疊。 在流動(dòng)腔實(shí)驗(yàn)中,將懸浮于緩沖液中的HL-60細(xì)胞溶液通入到底板鋪有P-選擇素的流動(dòng)腔腔體中,使位于HL-60細(xì)胞表面的P-選擇素糖蛋白配體-1(P-selectin glycoprotein ligand-1, PSGL-1)與鋪在底板上的P-選擇素相互作用,并測(cè)得其中的動(dòng)力學(xué)參數(shù)。在低P-選擇素濃度(200 ng/ml)條件下,HL-60細(xì)胞與底面的粘附為瞬時(shí)粘附(tether),這種粘附由單分子介導(dǎo),可測(cè)得P-選擇素/PSGL-1單分子鍵的生存時(shí)間(lifetime)。當(dāng)剪切力低于0.15 dyn/cm2時(shí),P-選擇素/PSGL-1的生存時(shí)間隨剪切力增加而增加,體現(xiàn)了逆鎖鍵的性質(zhì);當(dāng)剪切力高于0.15 dyn/cm2時(shí),生存時(shí)間隨剪切力增加而降低,體現(xiàn)了滑移鍵的性質(zhì)。在高P-選擇素濃度(500 ng/ml)條件下,P-選擇素/PSGL-1可介導(dǎo)HL-60細(xì)胞的滾動(dòng)粘附,模擬了血管壁內(nèi)白細(xì)胞的滾動(dòng)粘附現(xiàn)象。在此實(shí)驗(yàn)條件下,我們測(cè)定了細(xì)胞的平均滾動(dòng)速度(mean rolling velocity)、停留時(shí)間(stop time)、行走時(shí)間(go time)、停留頻率、行走頻率等參數(shù)。在低剪切力范圍內(nèi),隨著剪切力的增加,細(xì)胞滾動(dòng)速度和行走時(shí)間都出現(xiàn)先降低后增加的趨勢(shì),而停留時(shí)間則相反,先增加后降低,剪切閾值在0.15～0.175 dyn/cm2之間,與生存時(shí)間的趨勢(shì)一致。該結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了逆鎖鍵向滑移鍵轉(zhuǎn)變的這一重要現(xiàn)象,也解釋了為什么白細(xì)胞在正常情況下不會(huì)在血管壁內(nèi)發(fā)生滾動(dòng)粘附,而在炎癥反應(yīng)時(shí)會(huì)發(fā)生。 除了常規(guī)的正置流動(dòng)腔實(shí)驗(yàn)外,我們還進(jìn)行了創(chuàng)新性的倒置實(shí)驗(yàn),即將流動(dòng)腔體整個(gè)翻轉(zhuǎn),使細(xì)胞在反重力作用下在流動(dòng)腔的上表面進(jìn)行滾動(dòng)粘附。在此條件下測(cè)得的細(xì)胞平均滾動(dòng)速度比正置條件下要低,停留時(shí)間和停留頻率都與正置條件基本一致,而行走時(shí)間則比正置條件要低,說(shuō)明細(xì)胞滾動(dòng)速度的降低正是因?yàn)樾凶邥r(shí)間的降低造成的。行走時(shí)間的降低主要是因?yàn)樵诘怪脳l件下,細(xì)胞發(fā)生解離后如果沒(méi)有在短時(shí)間內(nèi)與壁面再次結(jié)合,細(xì)胞就會(huì)在重力和剪切流作用下快速遠(yuǎn)離壁面,而在正置情況下,因?yàn)橹亓Ψ较蛳喾?細(xì)胞從壁面脫離后不會(huì)遠(yuǎn)離壁面,會(huì)有機(jī)會(huì)再次與壁面結(jié)合。因此,倒置實(shí)驗(yàn)與正置實(shí)驗(yàn)的最大差別在于,倒置實(shí)驗(yàn)可以排除這些與壁面完全脫離的細(xì)胞,而只留下滾動(dòng)比較穩(wěn)定的細(xì)胞,從而得到更準(zhǔn)確的滾動(dòng)粘附參數(shù)。 血漿中的VWF由一到幾十個(gè)數(shù)量不等的二聚體首尾相接而成,分子量越大的VWF越容易發(fā)生聚集,同時(shí)增加血栓形成的機(jī)會(huì)。剛從內(nèi)皮細(xì)胞分泌后的VWF分子量比較大,經(jīng)金屬蛋白酶ADAMTS13 ( a disintegrin-like and metalloproteinase with thrombospondin type-1 motif-13, ADAMTS13)切割后才成為大小正常的VWF�；加醒ㄐ匝“鍦p少性紫癜(thrombotic thrombocytopenic purpura, TTP)的病人血漿中有很多超大型的VWF分子(ultralarge VWF multimers, UL-VWF),這是由于病人體內(nèi)的ADAMTS13有先天性缺陷或后天獲得性產(chǎn)生了ADAMTS13的抑制劑造成的。ADAMTS13作用于VWF的切割位點(diǎn)位于A2結(jié)構(gòu)域Tyr1605-Met1606之間。已有研究發(fā)現(xiàn),VWF A2結(jié)構(gòu)域的解折疊對(duì)于ADADMTS13是否發(fā)揮切割功能起到關(guān)鍵的作用,且重組蛋白構(gòu)建的單個(gè)A2結(jié)構(gòu)域的解折疊力已經(jīng)測(cè)得。然而,通常情況下A2結(jié)構(gòu)域被VWF中的其它結(jié)構(gòu)域所覆蓋和穩(wěn)定,比較穩(wěn)定,因此處于VWF多聚體中的A2結(jié)構(gòu)域的解折疊仍未被觀察。本研究使用了光鑷微吸管系統(tǒng)對(duì)VWF多聚體的拉伸進(jìn)行了研究。VWF多聚體拉伸后測(cè)得解折疊力為～21 pN的整數(shù)倍,解折疊長(zhǎng)度為～66 nm的整數(shù)倍。除A2結(jié)構(gòu)域外,VWF中所有的結(jié)構(gòu)域均有保持結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的分子內(nèi)二硫鍵,不容易在外力作用下發(fā)生解折疊,且解折疊長(zhǎng)度與A2結(jié)構(gòu)域氨基酸肽鏈的長(zhǎng)度相符,因此實(shí)驗(yàn)中測(cè)得的解折疊力與解折疊長(zhǎng)度極有可能為A2結(jié)構(gòu)域發(fā)生的解折疊。此外,為了驗(yàn)證這一推論,我們構(gòu)建了重組蛋白(A1-A2-A3)3,測(cè)得該蛋白的解折疊力(～23 pN)與解折疊長(zhǎng)度(～65 nm的整數(shù)倍)均接近于VWF多聚體。重組蛋白(A1-A2-A3)3的解折疊力與解折疊長(zhǎng)度與VWF多聚體的數(shù)據(jù)吻合,進(jìn)一步證明了這是A2結(jié)構(gòu)域在解折疊。 為了進(jìn)一步研究ADAMTS13 spacer結(jié)構(gòu)域?qū)WF的作用,我們構(gòu)建了只含有單個(gè)spacer結(jié)構(gòu)域的重組蛋白ST2。實(shí)驗(yàn)表明,ST2本身沒(méi)有切割功能,但它的加入可以促進(jìn)ADAMTS13對(duì)VWF的切割。經(jīng)光鑷?yán)鞂?shí)驗(yàn)驗(yàn)證,VWF多聚體在ST2存在的情況下,A2結(jié)構(gòu)域的解折疊力降低了一半,為～10 pN的整數(shù)倍。驗(yàn)證了ADAMTS13 spacer結(jié)構(gòu)域通過(guò)降低VWF A2結(jié)構(gòu)域的剛度使之更容易解折疊,從而促進(jìn)ADAMTS13對(duì)VWF的酶切作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：中山大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號(hào)】：R312

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本文編號(hào)：1646332