發(fā)布時(shí)間：2018-03-21 07:00

  本文選題：牛型布魯氏菌　切入點(diǎn)：蘋果酸脫氫酶　出處：《西南大學(xué)》2012年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：布魯氏菌病(Brucellosis)是由布魯氏菌(Brucella)引起的一種人獸共患慢性細(xì)菌性傳染病,該病在世界范圍內(nèi)廣泛流行并嚴(yán)重危害著人畜健康。布魯氏菌在宿主體內(nèi)生存能力極強(qiáng),在巨噬細(xì)胞內(nèi)具有極強(qiáng)的繁殖能力以及防止殺傷的自我保護(hù)能力,但其不具有經(jīng)典的毒力因子且不能引起強(qiáng)烈的先天性免疫,因而給布魯氏菌的防治帶來了很大的困難。體內(nèi)誘導(dǎo)基因涉及病原菌在體內(nèi)的生存和致病過程,本研究對本實(shí)驗(yàn)室篩選、鑒定的布魯氏菌體內(nèi)誘導(dǎo)抗原—蘋果酸脫氫酶的酶學(xué)特性及生物學(xué)功能開展研究,探討MDH在布魯氏菌致病過程的機(jī)制。 本研究以牛型布魯氏菌A19株基因組為模板,通過PCR技術(shù)擴(kuò)增出牛型布魯氏菌MDH的編碼基因Malate dehydrogenase (mdh),測序結(jié)果表明,該基因大小為936bp,與NCBI上公布的布魯氏菌2308(登錄號：NC_007618.1)序列100%同源。PCR產(chǎn)物經(jīng)酶切后與表達(dá)載體pET-28a(+)連接,成功構(gòu)建pET-28a-MDH重組質(zhì)粒,轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL-21(DE3),經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后,成功表達(dá)大小約為36KDa的融合蛋白His-MDH。通過優(yōu)化表達(dá)條件,His-MDH主要以可溶性方式表達(dá),利用表達(dá)載體pET-28a(+)上的6His-Tag標(biāo)記,通過Ni+親和層析柱成功對His-MDH進(jìn)行純化,為進(jìn)一步研究該蛋白的酶學(xué)性質(zhì)及免疫學(xué)特性奠定了基礎(chǔ)。 蘋果酸脫氫酶(MDH)是三梭酸循環(huán)中的一個(gè)關(guān)鍵酶,MDH以NAD+為輔因子,催化蘋果酸鹽與草酰乙酸鹽的相互轉(zhuǎn)化。本研究對表達(dá)、純化的布魯氏菌MDH的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了初步研究,結(jié)果表明：在體外催化蘋果酸鹽與草酰乙酸鹽的酶促反應(yīng)中,最適pH值為6.0,反應(yīng)最適溫度為42℃,在50℃以下酶的穩(wěn)定性較好,Zn2+、Pb2+和Cu2+對酶有明顯的抑制作用。酶動力學(xué)參數(shù)測得Km為0.67(mM),Vmax為0.91 (umol ml-1 min-1)。 生物信息學(xué)分析表明,該酶為四聚體,單體存在N一端的NAD結(jié)合區(qū)、催化區(qū)及C—端尾區(qū)三個(gè)結(jié)構(gòu)域,同時(shí)也存在與底物結(jié)合位點(diǎn),疏水結(jié)構(gòu)易形成酶的口袋結(jié)構(gòu),通過對不同細(xì)菌MDH的酶學(xué)活性位點(diǎn)分析,對布魯氏菌MDH可能存在的酶活位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測。以重組質(zhì)粒pET-28a-MDH為模板,采用重疊引物延伸PCR技術(shù)在布魯氏菌mdh基因中分別引入六個(gè)點(diǎn)突變(R89L、D149V、R152L、H176P、D178V、A231V)后與表達(dá)載體pET-28a(+)連接,轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)中,通過誘導(dǎo)表達(dá)與純化,成功獲得六個(gè)點(diǎn)突變的重組MDH。通過對MDH酶學(xué)活性的比較測定,結(jié)果發(fā)現(xiàn)除D178V點(diǎn)突變對酶活基本無影響外,其它五個(gè)點(diǎn)突變都可以使酶活完全喪失。 Western Blot檢測結(jié)果表明,重組His-MDH能與布魯氏菌陽性牛血清發(fā)生特異性反應(yīng),表明MDH具有免疫原性。用His-MDH作為包被抗原,對臨床收集的30份布魯氏菌陽性牛血清進(jìn)行ELISA檢測,結(jié)果所有被檢血清均為陽性反應(yīng),表明MDH可作為潛在的用于牛型布魯氏菌感染診斷的靶蛋白。生物信息學(xué)對MDH的氨基酸一級序列抗原性、親水性、表面可及性以及柔韌性等指標(biāo)的分析,一共預(yù)測了8條B細(xì)胞線性表位。此外,對MDH的亞定位結(jié)果表明,MDH為膜相關(guān)蛋白；纖連蛋白和纖連蛋白溶酶原結(jié)合活性分析以及布魯氏菌感染的Hela細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明：MDH蛋白具有纖連蛋白和纖連蛋白溶酶原結(jié)合活性,參與布魯氏菌對宿主細(xì)胞的入侵過程。 本研究通過對布魯氏菌蘋果酸脫氫酶酶學(xué)性質(zhì)以及免疫學(xué)特性研究,對闡述MDH參與布魯氏菌致病過程中的作用提供依據(jù),為進(jìn)一步基于MDH在牛型布魯氏菌在診斷、藥物及疫苗研究提供理論基礎(chǔ)。
[Abstract]:Brucellosis (Brucellosis) by Brucella (Brucella) caused by a chronic zoonotic bacterial infectious disease, the disease in the world widely popular and serious harm to human and animal health. In vivo Brucella survival ability is very strong, has the very strong ability of reproduction and to prevent the destruction of self-protection capability in macrophages inside, but it does not have the classic virulence factors and can not be caused by innate immunity strong, so to the prevention of brucellosis has brought great difficulties. In vivo induced genes involved in pathogen survival and pathogenesis in vivo, the research on the screening laboratory, to carry out research on the identification of Brucella in vivo induced antigen - malate dehydrogenase enzymatic properties and biological function of MDH in the mechanism of Brucella virulence process.
In this study, bovine Brucella strain A19 genome as template, amplified by PCR from bovine Brucella MDH gene encoding Malate dehydrogenase (MDH), gene sequencing results showed that the size of 936bp, and NCBI released 2308 Brucella (accession number: NC_007618.1) 100% sequence homology.PCR products digested with expression the vector pET-28a (+) is successfully constructed pET-28a-MDH plasmid was transformed into Escherichia coli BL-21 (DE3), induced by IPTG, expression of 36KDa fusion protein was about His-MDH. by optimizing the expression conditions, His-MDH is mainly expressed in the soluble form, using the expression vector pET-28a (+) 6His-Tag labeled by Ni+. Affinity chromatography was used to purify His-MDH successfully, which laid the foundation for the further study of enzymatic properties and immunological properties of the protein.
Malate dehydrogenase (MDH) is a key enzyme of three carboxylic acid cycle, MDH to NAD+ cofactor, catalyzes the interconversion of malate and oxaloacetate. The study on the expression and enzymatic properties of the purified MDH of Brucella was studied. The results showed that in vitro catalytic malate and oxalacetate the enzymatic reaction, the optimum pH value was 6, the optimum temperature is 42 DEG C below 50 DEG C in reaction, enzyme stability is better, Zn2+, Pb2+ and Cu2+ have obvious inhibitory effect on the enzyme. The enzyme kinetic parameters measured Km was 0.67 (mM), Vmax 0.91 (umol ml-1 min-1).
Bioinformatics analysis showed that the enzyme is a tetramer with four monomers of N end of the NAD binding region, catalytic domain and C - end of three domains of tail area, there is also a binding site and substrate structure to form hydrophobic pocket structure of enzyme, the enzyme activity of different bacterial MDH site analysis that may exist on Brucella MDH activity sites were predicted. The recombinant plasmid pET-28a-MDH as template, using overlapping primer extension PCR in Brucella MDH gene were introduced into six point mutations (R89L, D149V, R152L, H176P, D178V, A231V) and the expression vector pET-28a (+) connected into Escherichia coli BL21 (DE3), and purified by inducing the expression of recombinant MDH., successfully obtained six point mutation by comparison on Determination of MDH enzyme activity. The results show that in addition to D178V point mutation has no effect on enzyme activity, the other five point mutations can make the enzyme completely lost Lost.
Western Blot assay showed that the recombinant His-MDH could react specifically with Brucella positive bovine serum, showed that MDH had immunogenicity. Using His-MDH as antigen ELISA was detected in 30 Brucella positive bovine serum collection of clinical results, all tested serum were positive, indicating that MDH can be used as a target for protein in the diagnosis of bovine type Brucella infection potential. The bioinformatics of MDH amino acid sequences analysis of hydrophilicity, antigenicity, surface accessibility and flexibility index, a total of 8 predicted B cell linear epitopes. In addition, the sub localization of MDH showed that MDH is a membrane associated protein fiber; fibronectin and fibronectin plasminogen binding activity analysis and Brucella infection Hela cell experiments showed that MDH protein with fibronectin and fibronectin plasminogen binding activity in Bruce strains of The invasion process of the host cell.
This study provides a basis for elucidating the role of MDH in the pathogenesis of Brucella by studying the enzymatic properties and immunological characteristics of Brucella malate dehydrogenase, and provides a theoretical basis for further research based on MDH in the diagnosis, drug and vaccine of Brucella bovis.

【學(xué)位授予單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號】：R378;S852.61

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