本文選題：弓形蟲　切入點：PCR-RFLP　出處：《安徽醫(yī)科大學》2011年碩士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：目的本實驗主要目的是探討國內(nèi)貓體內(nèi)弓形蟲的基因型別是否會因為地域差異而產(chǎn)生不同,同時觀察從貓體內(nèi)分離到的弓形蟲的毒力強弱。 方法分別從安徽,湖北,山西和廣東四省收集貓的標本,其中安徽22只,湖北23只,山西24只,廣東20只。每只貓都用乙醚麻醉后殺死,取腦、舌、心臟組織各20克左右。將貓的腦、舌和心臟在剔除結締組織后放入一個50m1的離心管中并用剪刀剪碎、碾缽碾壓成肉糊狀。然后,將這些糊狀物靜置于10ml無菌生理鹽水中,再加入同體積的鹽酸胃蛋白酶。將該混合液置37℃水浴搖床中搖勻一個小時后進行離心,調(diào)節(jié)PH并加入抗生素。取上述混合液,腹腔注入5只小鼠,每只注入0.5m1。密切觀察小鼠,當發(fā)現(xiàn)有明顯的癥狀時,殺死小鼠并抽取腹腔液于顯微鏡下觀察,最后總共發(fā)現(xiàn)14株弓形蟲。為了觀察每株弓形蟲的毒力,我們隨機選擇了14組(每組10只)6周齡昆明雌鼠,每只小鼠腹腔感染約1000個速殖子。逐日觀察并記錄小鼠的發(fā)病及死亡情況。在小鼠即將死亡前從其腹腔液中提取弓形蟲的DNA。總共選擇9個基因位點SAG2、SAG3、BTUB、GRA6、L358、PK1b、c22-8、c29-2和Apico。PCR反應體系25u1。包含2ul PCR buffer、2.5ul MgCl2、2ul dNTPs、0.5mM的上下游引物、0.3單位的ExtraDNA酶、lul DNA樣本和18.2u1H2O。參考蟲株為Ⅰ(RH株),Ⅱ(PRU株)和Ⅲ(CTG株).為了明確每株的型別,取10ul的PCR產(chǎn)物,然后用相應的內(nèi)切酶酶切,反應條件參照每種酶的特定溫度,酶切后產(chǎn)物用2.5%的瓊脂糖凝膠電泳,將待檢株同三個標準基因型別進行比較。 結果從四省收集的89只貓體內(nèi)共收集到14株蟲株,分別命名為Tgctys1、Tgctys2、Tgctwh1、Tgctwh2、Tgctwh3、Tgctwh4、Tgctwh5、Tgctwh6、Tgctwh7、Tgctwh8、Tgctgd1、Tgctgd2、Tgctsx1、Tgctsx2。四省貓源性弓形蟲的分檢率以湖北省最高達到34.8%,其余三省均在10%左右。除Tgctwh6和Tgctwh8為弱毒株外,其余各株均為強毒株,在感染的120只小鼠中,有115只在感染后4-8天死亡(死亡率95.8%)。PCR-RFLP的分型結果發(fā)現(xiàn)了兩個基因型別,命名為#1和#2型,二者均為雜合型。#1型在各個位點的鑒別結果是：在SAG2、GRA6、L358、PK1b、C22-8和C29-2位點同參考株Ⅱ；在SAG3、BTUB位點同參考株Ⅲ；在Apico位點同參考株為Ⅰ。#2型在SAG3,、BTUB和GRA6三個位點上顯示較為特別的電泳條帶均不同于上述參考株,其它其余各位點同#1。沒有發(fā)現(xiàn)經(jīng)典典型的Ⅰ,Ⅱ和Ⅲ型株。其中有12株為#1型,占到85.7%。本次發(fā)現(xiàn)的#1同朱興權等前期對中國廣東省貓體內(nèi)弓形蟲研究中占82.2%的#3基本相同。#2基因型過去在我國未見報道。為成囊的弱毒株,在感染的20只小鼠中,只引起2只死亡。 結論1.從本次實驗來看地域的變化對中國國內(nèi)貓體內(nèi)的弓形蟲基因型別的影響較小。且從分離到的基因型別分析是以雜合型為主。#1占到85.7%可能為流行我國的主要基因型2.#1對小鼠有較強的致死率。3.#2是首次在中國發(fā)現(xiàn)說明也是有少數(shù)其它的基因型別存在于貓的體內(nèi)。
[Abstract]:Objective to investigate whether the gene types of Toxoplasma gondii in domestic cats are different due to regional differences, and to observe the virulence of Toxoplasma gondii isolated from cats. Methods the cat specimens were collected from Anhui, Hubei, Shanxi and Guangdong provinces, including 22 cats from Anhui Province, 23 from Hubei Province, 24 from Shanxi Province, and 20 from Guangdong Province. The brain, tongue and heart of the cat were removed from connective tissue and placed in a 50m1 centrifuge tube, shredded with scissors and crushed into a meat paste. Then, the paste was statically placed in 10 ml sterile saline. Then add pepsin hydrochloride of the same volume. Shake the mixture in 37 鈩，

本文編號：1633941