本文選題：日本血吸蟲　切入點：抗原　出處：《南京醫(yī)科大學》2012年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：血吸蟲病是一種嚴重危害人類健康的人獸共患寄生蟲病，在世界范圍內廣泛分布，全球七十四個流行國家中至今仍有約七億人口受到血吸蟲病威脅，兩億人口受到血吸蟲病感染，其中有兩千萬人有較重的臨床癥狀并伴有不同程度的勞動力喪失，且每年至少還有兩萬人死于血吸蟲病。在我國流行的是日本血吸蟲病，雖然經過半個多世紀的努力，血吸蟲病的流行程度已大大減低。但是，至2010年底，在全國七個流行省份的92個縣中仍有三十余萬的血吸蟲病患者。因此，血吸蟲病的防治和研究工作仍然面臨著嚴峻的挑戰(zhàn)。 作為一種危害嚴重的多細胞寄生蠕蟲，日本血吸蟲侵入宿主機體后可引發(fā)復雜的免疫應答。隨著對日本血吸蟲免疫學研究的不斷深入，人類正在一層層揭開日本血吸蟲與其適宜宿主人類之間關系的面紗。大量研究已歸納出日本血吸蟲感染后宿主免疫應答的特征，即感染后最初的2-4周，宿主在移行中的童蟲刺激下，呈現(xiàn)Th1型(IFN-g，TNF)優(yōu)勢應答；一旦成蟲開始產卵，Th1型應答迅速下降，并持續(xù)呈現(xiàn)出Th2型（IL-4，IL-13，IL-10，IL-5）優(yōu)勢應答。可見蟲卵抗原產生前后，宿主體內的細胞因子微環(huán)境也因此發(fā)生了變化。但到目前為止，對這一免疫現(xiàn)象背后更為深入的免疫機制還未被完全闡明。由此，繼續(xù)探索這一免疫應答及其調節(jié)機制，從而通過人工調節(jié)，使免疫應答向著有利于人體的方向發(fā)展就顯得極為重要。 巨噬細胞在人類免疫系統(tǒng)中占有獨特的位置，其是免疫系統(tǒng)第一個被確定的細胞成分,在機體正常生理過程和病理過程中發(fā)揮極其重要的作用。目前研究發(fā)現(xiàn)，在不同的環(huán)境中，巨噬細胞可以分化為行使特定免疫角色的不同細胞亞群。在不同微環(huán)境中，巨噬細胞主要分為兩種類型：M1型，即經典活化的巨噬細胞(classically activated macrophage)，其可直接吞噬和殺傷病原微生物和腫瘤細胞，分泌促炎因子和趨化因子，并通過遞呈抗原參與正向免疫應答，發(fā)揮免疫監(jiān)視的功能； M2型，即替代性活化的巨噬細胞(alternatively activatedmacrophage)。其可在M-CSF、 IL-4、 IL-13、 IL-10、糖皮質激素、轉化生長因子-β(TGF-β)、維生素D3和前列腺素E2(PGE2)等作用下誘導產生，其抗原遞呈能力較低，并通過分泌IL-10、 CCL17、 CCL18、 CCL22和TGF-β等抑制性細胞因子下調免疫應答。根據(jù)固有免疫參與并調控適應性免疫應答的啟動，和影響特異性免疫應答的強度與類型，以及抗原刺激啟動和調節(jié)適應性免疫應答的關鍵在于Mφ和DC等固有免疫細胞作用的認知，研究在血吸蟲感染中固有免疫細胞與抗原相互作用可能發(fā)揮的免疫調節(jié)影響應是理所當然的關注重點。鑒于Mφ是血吸蟲蟲卵肉芽腫炎癥中的主要細胞成分，而血吸蟲感染全過程的宿主免疫應答經歷了由I型（Th1）向II型（Th2）的漂移，漂移的結點正好是以成蟲產卵為界，提示了Mφ在此過程中可能發(fā)揮重要的免疫調節(jié)功能并推論：通過成蟲產卵前后抗原微環(huán)境的劇烈改變，從而誘導Mφ極化分型來指導和/或調節(jié)適應性免疫應答類型。本研究以這一設想作為我們關注的重點，通過體內體外實驗證明血吸蟲抗原刺激和巨噬細胞極化的相互關系，并探明Mφ極化分型的分子證據(jù)。 本研究實驗設計的技術路線為：在體外使用經典的M1誘導劑IFN-γ/LPS和M2誘導劑IL-4誘導處于M0狀態(tài)的小鼠巨噬細胞瘤系RAW264.7，建立以RAW264.7為試驗用細胞的巨噬細胞極化屬性識別系統(tǒng)，為了鑒定系統(tǒng)建立是否成功，分別對已報道的多個Mφ極化表型指標進行了檢測；為了考察日本血吸蟲生活史不同發(fā)育階段來源抗原誘導下巨噬細胞的極化情況，在體外，使用不同的日本血吸蟲抗原（正常尾蚴抗原NCA,輻照尾蚴抗原ACA,可溶性成蟲抗原SWAP,可溶性蟲卵抗原SEA）刺激RAW264.7，在體內，獲得日本血吸蟲自然感染不同階段來源的腹腔巨噬細胞(感染前0w，感染后3w，6w，9w)，分別從精氨酸代謝途徑，表面標志和細胞因子分泌三個方面對巨噬細胞極化類型進行了鑒定；為了證明不同極化狀態(tài)下的巨噬細胞參與了血吸蟲感染的免疫調節(jié)，運用ELISA方法分別從蛋白水平檢測不同來源日本血吸蟲抗原作用下巨噬細胞效應/抑制分子的表達；為了探明Mφ極化分型跟TLRs及相應通路的聯(lián)系，采用抗體封閉實驗考查TLR2和TLR4在巨噬細胞極化中的作用；此外，還運用流式細胞術檢測M1/M2極化狀態(tài)下，共刺激分子和共抑制分子的表達。主要研究結果如下： 1.在本實驗室條件下，成功建立了有效的Mφ極化分型的識別系統(tǒng)。 M1誘導劑IFN-γ/LPS和M2誘導劑IL-4可誘導處于M0狀態(tài)的小鼠巨噬細胞瘤RAW264.7，分別極化為M1和M2。 2.日本血吸蟲不同發(fā)育階段來源抗原可誘導Mφ向不同方向極化。日本血吸蟲正常尾蚴抗原NCA和輻照尾蚴抗原ACA都可刺激RAW264.7細胞相對于未刺激組表達高水平的inos，CD16/32也呈現(xiàn)出高表達，IL-12產生顯著增加(p0.01)，但NCA和ACA間無差異；日本血吸蟲蟲卵抗原SEA刺激RAW264.7細胞相對于未刺激組,IL-10產生顯著增加, CD206顯示了高表達，表達高水平的arg1。結果表明NCA和ACA可誘導Mφ向M1極化，SEA可誘導Mφ向M2極化，SWAP中因為成分復雜（含有SEA）可同時誘導M1和M2增加。 3.日本血吸蟲自然感染過程中存在Mφ極化漂移的現(xiàn)象。即隨著感染發(fā)展的進程，M1細胞表面標志的CD16/32表達在3周達到最高，從6周開始逐漸降低；M2細胞的表面標志CD206的表達從3周開始逐漸升高，在第9周達到最高。但在3-9周，我們還觀察到腹腔巨噬細胞根據(jù)F4/80熒光強度不同分為兩群，因為我們未能找到合適的技術手段分離這兩群巨噬細胞，并分別鑒定這兩群細胞的極化屬性，于是我們繼續(xù)通過檢測細胞因子IL-12、IL-10分泌和相關因子iNOS、Arg-1基因的表達來鑒定全部巨噬細胞的優(yōu)勢極化屬性。結果表明，產卵前腹腔巨噬細胞IL-12的基礎分泌量最高，之后表達逐漸減少，而IL-10的基礎分泌量在6w后開始顯著增加；inos的表達在3w達到最高，arg1在產卵后表達顯著升高。證明了產卵前巨噬細胞以M1方向極化為主，產卵后趨于M2方向。 4.巨噬細胞極化后通過分泌細胞因子參與調節(jié)日本血吸蟲感染過程中的免疫應答。巨噬細胞分泌的正向效應分子（TNF-α，IL-12）在產卵前占優(yōu)勢，而負向調節(jié)分子（IL-10，TGF-β）的分泌在產卵后占優(yōu)勢。 5. TLR4信號通路的存在會對巨噬細胞的極化產生影響。TLR2被拮抗后對CD16/32和CD206的表達，細胞因子IL-10和IL-12的分泌，iNOS和Arg-1的表達都沒有顯著性影響。而TLR4被拮抗后，NCA刺激Mφ后CD16/32和iNOS的表達與對照組相比顯著降低（P0.01），提示TLR4信號通路的存在對巨噬細胞向M1的極化有顯著的影響。而SEA刺激的CD206，IL-10，Arg-1的表達與對照組相比表達變化沒有顯著性，原因待深入探索，可能與拮抗劑的劑量依賴性有關。 6.共刺激分子CD40，CD86和共抑制分子PD-L1在不同發(fā)育階段來源的抗原刺激下表達均上調，故未發(fā)現(xiàn)正向和負向調節(jié)的共刺激分子可直接對應調節(jié)巨噬細胞極化屬性的證據(jù)。但NCA刺激巨噬細胞表達的PD-L1顯著高于SEA和SWA，NCA刺激巨噬細胞表達的CD86也顯著高于SEA和SWAP，提示如果共刺激分子參與巨噬細胞的極化的話，并不單一地依賴正向或負向調節(jié)的共刺激分子的作用，而可能取決于我們尚未認識的正向或負向信號間微妙的平衡調節(jié)。關于共刺激信號參與巨噬細胞極化調節(jié)及調節(jié)機制，在本研究中還只是停留在對實驗觀察結果的直觀描述和推論上，，但卻給我們留下了豐富的想像空間。 綜上所述，本研究明確了抗原微環(huán)境的變化確實是巨噬細胞極化的關鍵。不同日本血吸蟲抗原可以刺激巨噬細胞向不同類型極化，從而參與對日本血吸蟲感染引起的機體免疫應答變化的調控，如對細胞免疫方面由Th1向Th2方向的極化有所貢獻。這為未來從巨噬細胞極化屬性調節(jié)入手，尋找可供發(fā)展新型免疫抑制劑的蟲源性成分提供先導性實驗論據(jù)。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：南京醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2012
【分類號】：R392

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