本文選題：腎缺血再灌注　切入點：系膜細胞　出處：《復(fù)旦大學(xué)》2011年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：急性腎衰竭(acute renal failure, ARF)是由各種病因引起,腎功能在短期內(nèi)(數(shù)小時至數(shù)天)迅速減退,腎小球濾過功能顯著下降,血尿素氮及肌酐迅速升高,并引起機體水、電解質(zhì)和酸堿平衡失調(diào),以及急性尿毒癥等的臨床綜合癥狀。腎缺血再灌注導(dǎo)致的腎臟損傷(renal ischemia reperfusion injury, RIRI)是導(dǎo)致缺血性ARF的主要原因,在器官移植中更是難以避免。RIRI發(fā)生機制復(fù)雜,涉及自由基的作用、細胞鈣超載、能量代謝障礙等,有資料顯示炎性介質(zhì)、粘附分子、多種細胞因子參與RIRI,但至今其發(fā)病機制尚未完全闡明。 急性腎衰竭中腎臟損傷若不能及時修復(fù),可導(dǎo)致病變持續(xù)數(shù)周甚至多年,轉(zhuǎn)變成不可逆的慢性進行性腎功能不全。2010年12月,Kidney International雜志連續(xù)刊登5篇review,均把腎移植后腎功能變化的關(guān)注焦點集中在遠期效應(yīng)上從對腎移植后的遠期保護性干預(yù)、感染與慢性移植腎損傷、病理學(xué)改變等方面探討了慢性移植損傷。關(guān)于腎缺血再灌注(ischemia reperfusion, I/R)的研究,局限于24 hr以內(nèi)的急性期和單一的觀察時間點明顯不夠,因此,在本課題中選擇了缺血再灌注6hr、24hr、3d、7d和21d作為觀察時間點,以充分反應(yīng)急性期和亞急性期的腎損傷情況。 硫化氫(hydrogen sulfide, H2S)是繼一氧化碳和一氧化氮之后的又一內(nèi)源性氣體信號分子,近年來H2S在體內(nèi)的生物學(xué)效應(yīng)受到廣泛關(guān)注。最新研究表明其在機體內(nèi)參與多種生物學(xué)功能調(diào)節(jié),內(nèi)源性H2S代謝異常與多種系統(tǒng)疾病,包括循環(huán)、消化、神經(jīng)、呼吸等系統(tǒng)疾病發(fā)生關(guān)系密切。 內(nèi)源性H2S主要有兩大來源：酶合成途徑和非酶途徑。酶合成途徑是體內(nèi)H2S的主要來源,通過體內(nèi)的半胱氨酸5-磷酸毗哆醛依賴性的酶—胱硫醚-β-合成酶(cystathionine-1-cynthase, CBS)和胱硫醚-γ-裂解酶(cystathionine-γ-lyase,CSE)催化產(chǎn)生H2S。CBS和CSE的表達具有組織特異性,腎臟中同時存在CBS和CSE表達,且H2S合成水平較高。然而關(guān)于內(nèi)源性H2S在腎臟生理與病理生理過程中的作用至今報道很少,且主要圍繞高血壓腎病和糖尿病腎病。 本課題組前期報道了H2S對糖尿病腎病具有保護作用,明確糖尿病早期CSE表達減少,與高糖引起的腎臟組織氧化應(yīng)激發(fā)生有關(guān)。在離體培養(yǎng)的腎小球系膜細胞中,外源性給予NaHS (H2S供體)可抑制高糖引起的活性氧增多。活性氧生成增加是缺血再灌注致器官損傷的共同特征和重要機制。關(guān)于H2S在I/R中的作用,已有的文獻報道,在心血管系統(tǒng)中,特別是心肌缺血再灌注中,H2S能緩解心肌損害,然而,在腎臟缺血再灌注過程中,內(nèi)源性H2S生成有何變化,H2S能否通過緩解腎臟I/R氧化應(yīng)激的發(fā)生而發(fā)揮保護作用,如果H2S能有保護作用,其在體內(nèi)的作用途徑和具體機制是什么等都是我們在本課題中關(guān)心的問題。 腎小球系膜細胞(mesangial cells, MCs)是腎小球內(nèi)一種固有的血管外周細胞,具有舒縮功能,參與腎小球血流量的調(diào)節(jié)。目前已有大量實驗研究證實,MCs的異常增殖、細胞外基質(zhì)(extracellular matrix, ECM)的合成和分泌異常升高是腎小球硬化最重要的原因。以往對I/R的損傷研究集中于腎小管細胞,但在我們的實驗中明確觀察到,I/R可引起腎臟炎癥因子和纖維化相關(guān)細胞因子的表達成倍上調(diào),且腎皮質(zhì)的變化早于髓質(zhì),提示腎小球固有細胞可能在其中發(fā)揮作用。2010年Kim的報道也提示,在RIRI的發(fā)生機制中,腎臟的不同細胞可以表現(xiàn)出不同的應(yīng)答模式。然而,關(guān)于MCs是否參與RIRI,特別是急性期過后的腎損傷則沒有明確答案。因此,本課題中,我們結(jié)合整體動物模型的觀察結(jié)果,選擇腎小球系膜細胞作為離體研究的對象,采用缺氧-復(fù)氧模型開展研究。 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress, ERS)是指內(nèi)質(zhì)網(wǎng)受到諸如缺血、缺氧、鈣超載、ATP耗竭等應(yīng)激刺激,導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)未折疊蛋白、錯誤折疊蛋白堆積等引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)乃至細胞功能紊亂的狀態(tài)。ERS是細胞的一種自我保護性機制,適度的ERS可通過激活未折疊蛋白反應(yīng)(unfolded protein response, UPR)來保護由ERS所引起的細胞損傷,恢復(fù)細胞功能。但過強或時間過長的ERS則將誘導(dǎo)一系列細胞因子的大量釋放,甚至啟動細胞凋亡機制最終導(dǎo)致細胞凋亡。 腎缺血和再灌注可引起細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激發(fā)生,后者又與腎缺血再灌注損傷的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后密切相關(guān)。一方面有研究表明,缺血再灌注可啟動強烈的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng),并激活細胞凋亡途徑；但同時,翼志勇等報道,通過預(yù)處理誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激發(fā)生可有效減少I/R引起的腎損傷。ERS作為一把雙刃劍,是參與I/R的損傷機制還是在其中發(fā)揮保護作用,硫化氫對ERS又有何作用等也是本課題所關(guān)心的問題。 由此,本論文由三部分組成： 一、缺血再灌注損傷過程中內(nèi)源性H2S生成改變及給予外源性H2S對缺血再灌注腎損傷的緩解作用 1.本課題研究采用夾閉大鼠腎動脈造成腎雙側(cè)缺血,60 min后恢復(fù)血供進行再灌注的腎臟缺血再灌注動物模型。首先于缺血再灌注后6 hr觀察到腎皮質(zhì)H2S濃度低于假手術(shù)組,但腎髓質(zhì)尚無變化。外源性給予NaHS (100μg/kg)對假手術(shù)大鼠血肌酐、尿素氮無影響,也不引起正常大鼠腎臟的形態(tài)學(xué)改變。 2.實驗共收集5個時間點的動物樣本,分別為再灌注后6hr、24hr、3d、7d和21 d,收集樣本包括24小時尿液、血清和腎臟組織。。腎功能和尿蛋白結(jié)果顯示,腎缺血再灌注后6hr, I/R組血肌酐、尿素氮已顯著升高,隨時程延長,雖有緩解,但血肌酐、尿素氮數(shù)值始終高于假手術(shù)組。HE染色同樣提示腎臟存在病理改變。 3.腎組織缺血后50 min,即再灌注前10 min,腹腔注射NaHS,作為I/R+NaHS組。對該組大鼠腎功能、尿蛋白和病理形態(tài)學(xué)觀察的結(jié)果顯示,腎缺血再灌注后的急性期內(nèi),即6 hr和24 hr的腎臟功能和形態(tài)學(xué)改變與I/R組一致,但7d和21d時都顯著優(yōu)于I/R組,提示再灌注前外源性給予H2S可以改善缺血再灌注腎臟亞急性期的損傷效應(yīng)。 4.炎癥因子的異常啟動,腎臟組織出現(xiàn)非特異性炎癥反應(yīng)是造成再灌注損傷的重要因素,其中白介素6(interleukin 6, IL-6)是參與腎臟非特異性炎癥反應(yīng)的重要炎癥因子之一。本實驗中檢測了大鼠血清IL-6水平,觀察到缺血再灌注6 hr后,I/R與I/R+NaHS組血清IL-6水平均有顯著上升,較假手術(shù)組高出近3倍,此后,IL-6水平下降,但I/R組仍持續(xù)高于假手術(shù)組,而I/R+NaHS組則從24 hr起即與假手術(shù)組無差別。。腎臟皮質(zhì)IL-6 mRNA水平I/R組在5個觀察時間點都顯著升高,峰值出現(xiàn)在24 hr,約為假手術(shù)組的8倍。I/R+NaHS組腎皮質(zhì)IL-6表達水平也顯著升高,但低于I/R組。腎臟髓質(zhì)IL-6表達水平I/R組與I/R+NaHS組在缺血再灌注后6 hr都無明顯變化。I/R組從24 hr點起,表達水平顯著升高,3d時達高峰,可達假手術(shù)組的6倍。I/R+NaHS組自3d起,也觀察到IL-6 mRNA表達上調(diào),但低于I/R組。上述結(jié)果提示,腎組織IL-6水平在腎缺血再灌注后出現(xiàn)明顯的升高,且主要來源并非血液循環(huán)。腎皮質(zhì)的表達水平升高早于髓質(zhì)。給予外源性H2S能部分抑制IL-6生成的增多,減輕非特異性炎癥反應(yīng)。 單核細胞趨化因子(monocyte chemoattractant protein-1, MCP-1)是趨化因子家族的重要成員,在腎損害中起著重要作用。本實驗中也觀察了腎皮質(zhì)MCP-1的表達水平,其在I/R組和I/R+NaHS組表現(xiàn)出了與IL-6同樣的變化趨勢,進步確認了I/R可引起組織局部非特異性炎癥反應(yīng)的發(fā)生,及H2S能抑制該反應(yīng)的效應(yīng)。 5.腎臟纖維化是導(dǎo)致腎功能減退的重要病理改變之一。轉(zhuǎn)化生長因子(transforming growth factor-β, TGF-β)是促進纖維化的重要細胞因子。本實驗中檢測了腎皮質(zhì)TGF-β的mRNA水平,觀察到24 hr I/R與I/R+NaHS組TGF-β表達水平并未出現(xiàn)明顯變化。但3d起,表達水平顯著升高,I/R組TGF-βmRNA水平約為假手術(shù)組的8倍,I/R+NaHS組則顯著低于I/R組。纖維粘連蛋白(fibronectin, FN)是TGF-β重要的下游效應(yīng)分子,也是腎組織重要的細胞外基質(zhì)成分,與TGF-β共同參與了腎纖維化的進程。本實驗中觀察到腎皮質(zhì)FN mRNA水平在I/R組和I/R+NaHS組表現(xiàn)出與TGF-β相一致的變化趨勢,提示腎臟在缺血再灌注急性期過去后,可出現(xiàn)纖維化相關(guān)基因的表達上調(diào),這可能是遠期腎臟發(fā)生纖維化并引起腎功能減退的重要原因。而外源性給予H2S能顯著抑制上述基因的表達上調(diào),提示H2S將可能有助于緩解腎纖維化的發(fā)生與發(fā)展以及繼發(fā)的慢性腎功能損傷。 二、H2S抑制I/R引起的組織活性氧生成及缺氧-復(fù)氧引起的系膜細胞功能變化 1.腎缺血再灌注后6 hr、24 hr、3d、7 d和21d分別收集腎臟組織,勻漿后以lucigenin為探針,用化學(xué)發(fā)光技術(shù)定量測定組織活性氧水平。結(jié)果顯示,腎缺血再灌注引起腎組織內(nèi)活性氧(reactive oxygen species, ROS)水平升高,外源性給予硫化氫可抑制ROS生成的增多。 2.課題研究選擇離體培養(yǎng)腎臟系膜細胞作為細胞水平研究的對象,將細胞置于缺氧試劑盒中培養(yǎng)2 h,然后恢復(fù)常氧繼續(xù)培養(yǎng),建立缺氧-復(fù)氧(hypoxia/reoxygenation, H/R)細胞模型,模擬機體缺氧／再灌注損傷模型。利用DCFH-DA熒光探針進行細胞水平活性氧檢測,觀察到缺氧2h后復(fù)氧時,細胞ROS水平顯著升高,隨后下降,在復(fù)氧2h恢復(fù)至對照水平,繼而再次升高,在6h達峰值,并于12 h再次恢復(fù)至對照水平。采用缺氧前和復(fù)氧初兩次給予NaHS (30μM),可抑制H/R引起的ROS生成增多。僅缺氧前給予NaHS預(yù)處理,雖然對復(fù)氧初的ROS增多有一定抑制作用,但對后繼出現(xiàn)的第二次ROS水平升高無顯著影響。若僅在復(fù)氧后給予NaHS,則可明顯抑制第二次ROS生成高峰,提示H/R引起的ROS增多可出現(xiàn)兩次高峰,其中缺氧可能與第一次高峰的出現(xiàn)有關(guān),而復(fù)氧引起ROS第二次高峰。因此,復(fù)氧后給予NaHS處理可抑制ROS生成的第二個高峰。 3.H/R引起系膜細胞IL-6 mRNA表達增加,培液IL-6水平升高,在復(fù)氧初給予NaHS,可顯著抑制上述效應(yīng),提示在細胞水平,H2S也抑制了非特異性炎癥反應(yīng)。另外,NaHS還可抑制H/R引起的系膜細胞增殖效應(yīng)。由于腎小球硬化,腎臟纖維化等病理變化中,系膜細胞過度增殖及分泌的細胞因子都起了重要作用,因此,NaHS抑制H/R引起的IL-6水平升高和系膜細胞的增殖作用,在整體上可能是其改善腎缺血再灌注后腎損傷的細胞機制之一。 4.實驗中給予NADPH氧化酶抑制劑二亞苯基碘(diphenylenechloride iodonium,DPI)后,可完全抑制H/R引起的ROS增多,提示H/R引起的ROS生成增加主要來自NADPH氧化酶代謝途徑。給予DPI處理也抑制了H/R引起的IL-6 mRNA表達上調(diào)和系膜細胞增殖效應(yīng),提示IL-6的生成和細胞的增殖是由ROS生成增加所致。 三、腎缺血再灌注激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激 1.腎缺血再灌注后,腎組織可觀察到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的標志性蛋白葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78 (glucose regulating protein 78, GRP78)水平顯著升高。在細胞水平,缺氧-復(fù)氧引起系膜細胞GRP78蛋白水平和真核起始因子2α(eukaryotic initiation factor 2α, eIF2α)磷酸化水平升高,提示腎臟缺血再灌注或細胞缺氧-復(fù)氧可引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)發(fā)生。 2.給予外源性H2S抑制了24 hr時間點觀察到的缺血再灌注引起的組織內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及缺氧-復(fù)氧后12 hr時間點時所觀察到的系膜細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)。在離體培養(yǎng)的系膜細胞中,單純給予NaHS不影響正常細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激水平。 3.在系膜細胞上給予ERS誘導(dǎo)劑毒胡蘿卜素(thapsigargin, TG)或衣霉素(tunicamycin,TM)誘發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激,用NaHS預(yù)處理對TG或TM引起的GRP78蛋白水平和eIF2α磷酸化水平無影響,提示硫化氫本身對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可能無明顯直接抑制效應(yīng),其抑制腎缺血再灌注或缺氧-復(fù)氧引起的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可能與其抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激上游刺激因子,如ROS、炎癥因子等的生成有關(guān)。 綜上所述,本研究詳細觀察了腎缺血再灌注后早期腎臟功能、形態(tài)學(xué)、組織局部ROS、炎癥因子和纖維化相關(guān)細胞因子水平的變化過程,為尋找和闡明腎功能障礙的早期發(fā)生機制提供了有意義的實驗依據(jù)。課題中觀察到硫化氧可抑制缺血再灌注腎組織的活性氧升高,減少組織局部的炎癥因子和纖維化相關(guān)細胞因子的表達,這對于進一步揭示硫化氫本身的生物學(xué)作用以及對其在改善腎臟損傷中的機制研究和臨床應(yīng)用都有十分重要的意義。實驗中通過細胞水平缺氧-復(fù)氧模型觀察,與在整體動物缺血再灌注模型上的研究結(jié)果相結(jié)合,使研究結(jié)果較單一水平上得出的結(jié)論更為明確。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號】：R363

【參考文獻】

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1 冀志勇;景宇;張建國;李開龍;詹俊;林利容;何婭妮;;內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激預(yù)處理對大鼠急性缺血性腎損傷的保護作用[J];第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報;2010年12期

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本文編號：1614268