本文選題：高壓水注射　切入點(diǎn)：HBV　出處：《華中科技大學(xué)》2012年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)感染是全球重要公共衛(wèi)生問(wèn)題之一；而我國(guó)亦是HBV感染的高發(fā)區(qū)。但是，目前用于慢性HBV感染臨床治療的抗病毒藥物如干擾素和核苷類似物并不能徹底清除HBV。因此，研發(fā)新的藥物和探索新的治療措施是HBV研究領(lǐng)域亟待解決的重要問(wèn)題。 研發(fā)新的抗HBV藥物和探索新的治療措施離不開(kāi)合適的動(dòng)物模型。為了探索新的免疫調(diào)節(jié)治療策略，我們模擬免疫抑制或免疫功能損傷的HBV感染者，利用高壓水注射和免疫抑制劑建立HBV持續(xù)復(fù)制的BALB/c小鼠模型，并探索了免疫抑制劑影響HBV復(fù)制的免疫學(xué)機(jī)制。 目的 1.分別用不同濃度的地塞米松（Dexamethasome， DEX）、環(huán)磷酰胺（Cyclophosphamide，CYP）、雷帕霉素（Rapamycin，RAPA）、他克莫司（Tacrolimus，F(xiàn)K506）處理HepG2.2.15細(xì)胞，尋找安全的藥物濃度，并觀察安全藥物濃度下免疫抑制劑對(duì)HBV復(fù)制的影響。 2.用免疫抑制劑處理BAL B/c小鼠，6天后給予尾靜脈高壓水注射質(zhì)粒pAAV/HBV1.2（A基因型）建立HBV復(fù)制小鼠模型。監(jiān)測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)小鼠的病原血癥和抗體反應(yīng)，分析免疫抑制處理與病毒持續(xù)復(fù)制時(shí)間之間的關(guān)系。 3.利用RAPA和生理鹽水分別處理BALB/c小鼠，，觀察對(duì)HBV持續(xù)復(fù)制的影響，同時(shí)檢測(cè)各組小鼠免疫應(yīng)答，特別是T細(xì)胞應(yīng)答與調(diào)節(jié)性T細(xì)胞應(yīng)答水平，通過(guò)分析病毒復(fù)制時(shí)間與外周和肝內(nèi)Treg的頻率、T細(xì)胞應(yīng)答的關(guān)系，探索Treg的早期活化對(duì)病毒復(fù)制及T細(xì)胞免疫應(yīng)答的影響，為闡明HBV感染的早期免疫應(yīng)答及其慢性化機(jī)制提供重要的實(shí)驗(yàn)和理論依據(jù)。 方法 1.分別用不同濃度地塞米松、環(huán)磷酰胺、雷帕霉素、他克莫司的新鮮培養(yǎng)基處理HepG2.2.15細(xì)胞，在第4天培養(yǎng)中止前4小時(shí)加入5g/l的MTT20ul，4小時(shí)后加入二甲亞砜，酶標(biāo)儀讀取OD570nm值；按細(xì)胞存活率大于95%判定此濃度對(duì)細(xì)胞無(wú)毒性，確定藥物的安全作用濃度。 2.使用上述免疫抑制劑的安全藥物濃度處理HepG2.2.15細(xì)胞，72小時(shí)后收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，觀察免疫抑制劑對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞HBsAg和HBeAg分泌的影響；提取細(xì)胞內(nèi)DNA，Southern Blot檢測(cè)免疫抑制劑對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞HBV DNA復(fù)制的影響。 3.分別用生理鹽水、他克莫司、地塞米松、環(huán)磷酰胺和雷帕霉素處理BALB/c小鼠，再將C57BL/6小鼠的皮瓣移植到BALB/c小鼠背部，觀測(cè)皮瓣的存活時(shí)間。從而證實(shí)這幾種免疫抑制劑治療能有效抑制機(jī)體的免疫系統(tǒng)進(jìn)而延長(zhǎng)移植皮瓣的存活時(shí)間。 4.分別用生理鹽水、他克莫司、雷帕霉素、地塞米松、環(huán)磷酰胺和Anti-asialo GM1抗體處理BALB/c小鼠，并將質(zhì)粒pAAV/HBV1.2由尾靜脈高壓水注射小鼠體內(nèi)，建立HBV復(fù)制的小鼠模型。定期采血，ECLIA檢測(cè)血清內(nèi)HBsAg、HBsAb、HBcAb的水平，同時(shí)抽提血清內(nèi)的HBV DNA，Real-Time PCR檢測(cè)血清內(nèi)的病毒滴度。分析不同的免疫抑制劑及NK抗體阻斷對(duì)BALB/c小鼠體內(nèi)HBV復(fù)制的影響。 5.分別給BALB/c小鼠生理鹽水持續(xù)處理、雷帕霉素持續(xù)處理，通過(guò)ELISA和Real-time PCR檢測(cè)血清病原學(xué)指標(biāo)動(dòng)態(tài)變化；在不同的時(shí)間點(diǎn)處死小鼠，采集血清樣本和肝脾并分離肝臟浸潤(rùn)的淋巴細(xì)胞和脾細(xì)胞，用HBs、HBc多肽刺激脾細(xì)胞后，Elispot檢測(cè)分泌IFN-γ的細(xì)胞頻率；CD4、CD25和FoxP3染色后流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)PBMC、脾細(xì)胞及肝臟浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞（liver infiltrating lymphocytes,LILs）中調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（regulatort T cell,Treg）頻率及功能的變化。同時(shí)抽提肝組織和脾細(xì)胞內(nèi)的RNA，Real-Time PCR檢測(cè)CD分子和抗病毒相關(guān)的細(xì)胞因子mRNA的表達(dá)水平。分析在尾靜脈高壓水注射的急性HBV復(fù)制小鼠模型中，免疫抑制劑與HBV復(fù)制持續(xù)時(shí)間之間的關(guān)系，從而探討病毒復(fù)制與T細(xì)胞應(yīng)答、Treg負(fù)性調(diào)控之間的關(guān)系，為闡明HBV感染早期免疫應(yīng)答及其慢性化機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)和理論依據(jù)。 結(jié)果 1. MTT實(shí)驗(yàn)表明幾種免疫抑制劑的安全作用濃度分別為：環(huán)磷酰胺0～1000ug/ml、地塞米松0～500ug/ml、他克莫司0～10ug/ml、雷帕霉素0～0.4ng/ml、阿德福韋0～1ug/ml，在上述范圍內(nèi)的濃度對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞無(wú)毒性，且對(duì)其HBsAg和HBeAg分泌無(wú)影響。 2.將C57BL/6小鼠的皮瓣移植到BALB/c小鼠中，生理鹽水處理組的皮瓣存活時(shí)間為8.67±1.86天，而他克莫司、地塞米松、雷帕霉素和環(huán)磷酰胺處理組的皮瓣存活時(shí)間明顯延長(zhǎng)，分別為21.50±3.09天、21.50±3.09天、20.00±0.71天、21.40±1.52天。 3.通過(guò)尾靜脈高壓水注射將質(zhì)粒pAAV/HBV1.2導(dǎo)入BALB/c小鼠體內(nèi)，所有小鼠均能迅速產(chǎn)生較高的抗原血癥和病毒血癥，小鼠注射后第3天左右抗原血癥和病毒血癥達(dá)到最高峰。生理鹽水處理組的病毒血癥和抗原血癥隨后逐漸下降，HBVDNA于4周后完全清除，8周后抗原血癥完全消失。而在免疫抑制劑處理期間，RAPA處理組、DEX處理組和CYP處理組的抗原血癥和病毒血癥均維持在較高的水平。處理停止后，RAPA處理組抗原血癥和病毒血癥緩慢下降，60%的動(dòng)物表達(dá)HBsAg持續(xù)時(shí)間超過(guò)6個(gè)月。DEX處理組停止治療后，病毒血癥快速清除，HBsAg的表達(dá)也急劇下降并維持在非常低的水平，60%的動(dòng)物表達(dá)HBsAg持續(xù)時(shí)間超過(guò)6個(gè)月。CYP處理組停藥后，病毒血癥和抗原血癥下降緩慢，80%的動(dòng)物表達(dá)HBsAg持續(xù)時(shí)間超過(guò)6個(gè)月。Anti-asialo GM1抗體處理組的抗原血癥較低，高壓水注射后第6周HBsAg完全清除。 4.生理鹽水處理組大多數(shù)動(dòng)物能產(chǎn)生HBsAb和HBcAb；雷帕霉素處理組部分動(dòng)物能產(chǎn)生HBcAb，無(wú)HBsAb產(chǎn)生；地塞米松和環(huán)磷酰胺處理組均不能產(chǎn)生HBsAb和HBcAb。 5.生理鹽水處理組小鼠血清HBsAg在高壓水注射后21天清除，HBVDNA在第30天處于檢測(cè)值下限；雷帕霉素處理組小鼠HBsAg和HBVDNA在第30天仍是陽(yáng)性。 6.生理鹽水處理組小鼠外周血單個(gè)核淋巴細(xì)胞中Treg的頻率從高壓水尾靜脈注射后第一天開(kāi)始升高，形成第一峰值，推測(cè)可能與高壓水尾靜脈注射導(dǎo)致的肝損傷所致；尾靜脈高壓水注射后14天PBMC Treg的頻率再次達(dá)到峰值；雷帕霉素處理組PBMC Treg頻率從高壓水注射后第3天開(kāi)始升高，直到第21天一直保持在相近水平。 7.生理鹽水處理組小鼠脾細(xì)胞中Treg頻率在高壓水注射后第10天和20天有升高，第30天恢復(fù)到初始水平。雷帕霉素處理組脾細(xì)胞Treg頻率在上述3各時(shí)間點(diǎn)均沒(méi)有升高。 8.生理鹽水處理組小鼠肝臟浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞中Treg頻率在高壓水注射后第10天、20天、30天均處于較低水平。雷帕霉素處理組LIL中Treg頻率在高壓水尾靜脈注射后第10天和第30天升高。 9.高壓水注射后第30天，雷帕霉素處理組動(dòng)物的脾細(xì)胞分泌IFN-γ的能力較NS治療組增強(qiáng)。 10.雷帕霉素處理抑制小鼠肝組織CD markers和細(xì)胞因子CD3, CD4,CD8, IFN-β,FasL, Perforin, TNFα, IFN-γ的表達(dá)，卻增強(qiáng)IL10、TGFβ和FoxP3的表達(dá)。 11.雷帕霉素處理組病毒持續(xù)復(fù)制，高壓水注射后第30天，所有小鼠肝組織內(nèi)均能檢測(cè)到明顯的HBV復(fù)制。但是在生理鹽水處理組，在高壓水注射后30天肝內(nèi)沒(méi)有HBV復(fù)制。 結(jié)論 1.地塞米松、環(huán)磷酰胺和雷帕霉素在安全濃度范圍內(nèi)對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞無(wú)明顯細(xì)胞毒性；且對(duì)HBsAg、HBeAg分泌、HBVDNA復(fù)制無(wú)影響；提示上述免疫抑制劑并不具有直接的促進(jìn)或抑制病毒復(fù)制的作用。 2.在高壓水注射的BALB/c小鼠模型中，用雷帕霉素、地塞米松和環(huán)磷酰胺處理能明顯延長(zhǎng)小鼠移植皮瓣的存活時(shí)間；明顯延長(zhǎng)HBV的復(fù)制時(shí)間。提示通過(guò)上述免疫抑制劑的處理能成功建立免疫抑制劑誘導(dǎo)HBV持續(xù)復(fù)制模型。 3.雷帕霉素可能通過(guò)Treg的活化及增強(qiáng)相關(guān)分子的表達(dá)從而導(dǎo)致HBV復(fù)制的持續(xù)。 本研究的創(chuàng)新點(diǎn) 1．以高壓水注射的急性HBV復(fù)制小鼠模型為背景，利用免疫抑制劑處理，建立免疫抑制劑誘導(dǎo)HBV持續(xù)復(fù)制小鼠模型，很好的模擬了臨床接受免疫抑制劑治療或機(jī)體免疫應(yīng)答受損的HBV感染者中病毒復(fù)制狀態(tài)，為研究上述患者的發(fā)病機(jī)制研究及治療措施評(píng)估提供了一個(gè)新的可用的動(dòng)物模型。 2．利用急性和慢性HBV復(fù)制小鼠模型，通過(guò)檢測(cè)病毒特異性T細(xì)胞、Treg及其相關(guān)分子功能在病毒清除或持續(xù)過(guò)程中的變化，探索了Teg在HBV持續(xù)性復(fù)制中的作用。 本研究的意義 在急性HBV復(fù)制的小鼠模型的基礎(chǔ)上，通過(guò)免疫抑制劑處理，成功地建立了HBV持續(xù)復(fù)制小鼠模型，為研究HBV感染的免疫學(xué)應(yīng)答和抗病毒治療提供了方便實(shí)用的小動(dòng)物模型。另外，我們?cè)诖嘶A(chǔ)上探討T細(xì)胞及Treg功能在急性和慢性HBV復(fù)制模型中的區(qū)別，為理解HBV感染過(guò)程中的免疫學(xué)應(yīng)答提供了新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
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【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號(hào)】：R512.62;R392;R-332

【參考文獻(xiàn)】

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1 林國(guó)和;王俊;李書(shū)紅;王謹(jǐn);徐立;李升平;;肝癌組織中TGF-β1表達(dá)與Treg浸潤(rùn)的關(guān)系及其臨床意義[J];癌癥;2010年04期

2 福軍亮;徐東平;趙平;陳黎明;張暉;周春保;姚金霞;榮義輝;王福生;;急慢性乙型肝炎患者外周血調(diào)節(jié)性T細(xì)胞鑒定與臨床意義分析[J];中華醫(yī)學(xué)雜志;2006年22期

本文編號(hào)：1614109