本文選題：人CD244　切入點：基因轉(zhuǎn)染　出處：《蘇州大學(xué)》2012年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：第一部分人CD244基因克隆及其基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞株的建立 【目的】構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)人CD244基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞株。 【方法】通過RT-PCR獲得人CD244全長cDNA，而后進(jìn)行PCR擴(kuò)增；將人CD244全長cDNA重組入逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體pEGZ-Term。經(jīng)測序正確后，通過脂質(zhì)體法將重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pEGZ-Term/CD244和輔助病毒載體共轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞293T；收集含有完整重組逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒的293T細(xì)胞培養(yǎng)上清，用以感染L929細(xì)胞和BaF細(xì)胞；采用Zeocin篩選，獲得Zeocin抗性的基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞，，并通過流式細(xì)胞術(shù)檢測Zeocin抗性的基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞GFP和CD244的表達(dá)。 【結(jié)果】成功克隆人CD244全長cDNA，并成功構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)人CD244的基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞株L929/CD244和BaF/CD244。 【結(jié)論】本研究成功構(gòu)建了穩(wěn)定表達(dá)人CD244的基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞株，為研制鼠抗人CD244單克隆抗體和研究CD244生物學(xué)功能奠定了基礎(chǔ)。 第二部分鼠抗人CD244單克隆抗體的研制 【目的】研制鼠抗人CD244單克隆抗體。 【方法】以穩(wěn)定表達(dá)人CD244的基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞株L929/CD244為免疫原，免疫6~8周齡的BALB/c小鼠；采用B淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)，將免疫小鼠的脾臟細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞SP2/0進(jìn)行細(xì)胞融合，并于HAT選擇性培養(yǎng)基中培養(yǎng)；以L929/CD244作為陽性篩選細(xì)胞株，并以轉(zhuǎn)染pEGZ-Term空載體的L929/mock細(xì)胞株和轉(zhuǎn)染重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pEGZ-Term/CD48的L929/CD48細(xì)胞株作為陰性對照，采用流式細(xì)胞術(shù)對雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行篩選；對所得陽性雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行多次克隆化培養(yǎng)，直至獲得持續(xù)穩(wěn)定分泌特異性鼠抗人CD244單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株；采用快速定性試紙法鑒定單抗亞型；采用間接免疫熒光法檢測單抗特異性，并分析所獲單抗對健康人PBMC中T細(xì)胞和不同來源的腫瘤細(xì)胞表面CD244分子的識別。 【結(jié)果】獲得l株持續(xù)穩(wěn)定分泌鼠抗人CD244單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，命名為21F8。經(jīng)快速定性試紙分析鑒定，21F8的重鏈為IgM，輕鏈為κ鏈；腹水形成陽性率為100%，腹水的收獲量平均為8ml/只。間接免疫熒光分析結(jié)果顯示：單抗21F8能夠特異性識別人CD244分子，并且能夠識別人白血病細(xì)胞株U937和健康人PBMC中T細(xì)胞表面的CD244分子。 【結(jié)論】成功獲得l株持續(xù)穩(wěn)定分泌鼠抗人CD244單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。
[Abstract]:The first part of Human CD244 Gene cloning and Establishment of Gene transfection Cell Line. [objective] to construct a stably expressed human CD244 gene transfected cell line. [methods] Human CD244 full-length cDNA was obtained by RT-PCR, and then amplified by PCR. The full-length cDNA of human CD244 was recombined into retrovirus expression vector pEGZ-Term.After sequencing, the recombinant plasmid pEGZ-Term. The recombinant retrovirus vector pEGZ-Term/CD244 and auxiliary virus vector were co-transfected into packaging cell 293T by liposome method. The culture supernatants of 293T cells containing intact recombinant retrovirus particles were collected to infect L929 cells and BaF cells. Zeocin resistant gene transfected cells were obtained and the expression of GFP and CD244 in Zeocin resistant gene transfected cells was detected by flow cytometry. [results] the full-length human CD244 cDNA was cloned successfully, and the transfected cell lines L929 / CD244 and Baf / CD244were successfully constructed. [conclusion] in this study, a stable expression of human CD244 gene transfected cell line was successfully constructed, which laid a foundation for the development of mouse anti-human CD244 monoclonal antibody and the study of the biological function of CD244. The second part: preparation of mouse monoclonal antibody against human CD244. [objective] to prepare mouse anti-human CD244 monoclonal antibody. [methods] Human CD244 gene transfected L929 / CD244 cell line was used as immunogen to immunize 68-week-old BALB/c mice, and the spleen cells of immunized mice were fused with myeloma cell SP2/0 by B lymphocyte hybridoma technique. L929 / CD244 was used as positive screening cell line, L929 / mock cell line transfected with empty pEGZ-Term vector and L929 / CD48 cell line transfected with recombinant retrovirus vector pEGZ-Term/CD48 as negative control. The hybridoma cells were screened by flow cytometry and the positive hybridoma cells were cloned and cultured for several times until the hybridoma cell lines secreting specific monoclonal antibodies against human CD244 were obtained. The monoclonal antibody subtype was identified by rapid qualitative assay, and the specificity of the monoclonal antibody was detected by indirect immunofluorescence assay, and the recognition of T cells and CD244 molecules on the surface of tumor cells from different sources in healthy human PBMC was analyzed. [results] A hybridoma cell line was obtained which continuously secreted murine anti-human CD244 monoclonal antibody and was named 21F8.The heavy chain of 21F8 was identified as IgMand the light chain was 魏 chain by rapid qualitative test paper analysis. The positive rate of ascites formation was 100 and the average yield of ascites was 8 ml / mouse. Indirect immunofluorescence analysis showed that McAb 21F8 could specifically recognize human CD244 molecule. And it can recognize the CD244 molecules on T cell surface in human leukemia cell line U937 and healthy human PBMC. [conclusion] A hybridoma cell line was successfully obtained which secreted murine anti-human CD244 monoclonal antibody stably and continuously.
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號】：R392

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本文編號：1613507